Investigation of SPO11 protein complexes which are essential for meiotic double strand break induction in plants
Evolution and Systematics of Plants and Fungi
Final Report Abstract
Das Projekt kann trotz einiger organisatorischer und technischer Schwierigkeiten als erfolgreich beendet angesehen werden. Im Laufe des Projektes konnte eine Ko- Lokalisation von SPO11-1 und SPO11-2 in frühen meiotischen Stadien bei Arabidopsis mittels der in diesem und im SPP1384 erzeugten Antikörpern gegen SPO11-1 und SPO11-2 durch eine Koimmunofluoreszenzfärbung mikroskopisch nachgewiesen werden. Dies unterstützt die Hypothese für das Vorhandensein eines SPO11-1/SPO11-2 Heterokomplexes in Arabidopsis. Weitere Untersuchungen mit diesen Antikörpern insbesondere zusammen mit einem Antikörper gegen MTOPVIB, den neu beschriebenen Kooperationspartner von SPO11-1 und SPO11-2, würden noch genaueren Aufschluss über die Zusammensetzung und Lokalisation eines solchen Komplexes ermöglichen. Weiterhin konnten neue und wichtige Erkenntnisse zur zeitlichen Regulation der Doppelstrangbruchinduktion durch SPO11 bei Arabidopsis über eine Analyse der Expression und der Spleiß-Varianten von SPO11-1 und SPO11-2 in Antheren unterschiedlicher Entwicklungsstadien erzielt werden. Gleichzeitig konnten mit diesem Ansatz neue und potentiell funktionelle Isoformen von SPO11-1 und SPO11-2 auf Transkriptomebene nachgewiesen werden. Eine Analyse von SPO-ligos, kurze an SPO11 gebundene DNA-Fragmente, zeigte abweichend von Hefe und Säugern kein gehäuftes Auftreten einzelner Genombereiche in den SPO-ligos. Somit konnten keine Bereiche im Genome identifiziert werden die häufiger als andere von SPO11 adressiert und geschnitten werden, was die Theorie von Regionen im Genom die gehäuft durch SPO11 geschnitten werden zumindest bei Pflanzen in Frage stellt. Das Erzeugen von chimären SPO11-Proteinen aus Arabidopsis mit N- und/oder C-terminalem Austausch von Regionen aus der relativ nah verwandten Papaya konnte die Frage nach einer funktionsbestimmenden Domäne ebenso wenig klären wie der Austausch eines konservierten Bereiches um das Motiv 4 zwischen SPO11-1 und SPO11-2 aus Arabidopsis. Alle diese Austausche führten, wie bereits viele Austausche im SPP1384, zu keiner funktionellen Komplementation, weder bei spo11-1-3 noch bei spo11-2-3 Knock-out Mutanten. Auch wenn auf Grund von technischen Schwierigkeiten nicht alle geplanten Austausche durchgeführt werden konnten ist die Chance das diese zu einem signifikanten Erkenntnisgewinn geführt hätten abschließend als gering anzusehen. Hiermit lässt sich feststellen, dass die Spezifität des jeweiligen Proteins SPO11-1 und SPO11-2 in mehr als einer Proteinregion lokalisiert ist. Ein entscheidendes Ereignis während der Laufzeit des Projektes war die Publikation von Vrielynck et al., welche die vorgesehenen Fragestellungen nach einem Interaktionspartner von SPO11-1 und -2 bei Arabidopsis beantwortete. Als Alternative wurde im Projekt eine Transkriptom-Analyse von spo11-1-3 und spo11-2-3 Mutanten gegen Col-0 Wildtyp und Überexpressionslinien von SPO11-1 und SPO11-2 durchgeführt. Diese Analyse ergab insbesondere für spo11-2-3 eine Vielzahl von differentiell exprimierten Genen die in weiteren Untersuchungen genauer analysiert werden sollten um eine eventuelle Funktion bei der Meiose zu analysieren. Die im Projekt erzielten Ergebnisse sollen zeitnah veröffentlicht werden.
