Untersuchung von SPO11-Proteinkomplexen, die essentiell für die meiotische Doppelstrangbruchinduktion bei Pflanzen sind

• Antragsteller: Dr. Frank Hartung
• Fachliche Zuordnung: Genetik und Genomik der Pflanzen ; Evolution und Systematik der Pflanzen und Pilze
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 277948232

Die meiotische Rekombination hängt in nahezu allen Eukaryoten von der Initiierung der Doppelstrangbrüche (DSB) durch die Meiose-spezifische Transesterase SPO11 ab. In Tieren und Pilzen ist nur ein einziges SPO11 im Genom kodiert und ausreichend, wohingegen in Pflanzen und anderen Eukaryoten zwei SPO11-Gene, SPO11-1 und 2 notwendig sind, um meiotische DSBs zu induzieren. Beide SPO11-Proteine sind sehr verschieden und müssen in katalytisch aktiver Form vorliegen, da ansonsten die Pflanzen auf Grund zufälliger Chromosomenverteilung nahezu steril sind. Aus unseren Immunfluoreszenz-Vorarbeiten ergeben sich erste Hinweise, dass SPO11-1 und -2 in Arabidopsis thaliana einen heterodimeren Komplex bilden, an diesem sind aber wahrscheinlich noch andere Proteine beteiligt. In beiden SPO11-Proteinen konnten wir mehrere Regionen identifizieren, die für die Funktion des jeweiligen SPO11-Proteins essentiell und spezifisch sind. In einer dieser Regionen wollen wir nun mehrere konservierte Aminosäuren mutieren (3 von ca. 20aa), da diese relativ kleine Region (Austausch Nr. 2) einen stark dominant-negativen Effekt hat und selbst im Arabidopsis Wildtyp-Hintergrund Sterilität erzeugt, nachdem wir sie zwischen den beiden SPO11-Proteinen ausgetauscht hatten. Außerdem ist geplant genau diese Region durch die entsprechende Sequenz aus Papaya (und anderen Pflanzen) zu ersetzen, um herauszufinden, ob sie in ihrer Funktion auch zwischen evolutionär weiter entfernten Pflanzen konserviert ist. Unter Verwendung der im auslaufenden Projekt neu hergestellten Antikörper gegen SPO11-2 ist es nun auch erstmalig möglich über Co-Immunopräzipitation die Proteine zu erfassen, die an SPO11-2 binden oder damit interagieren. Zusätzlich zu den Untersuchungen über Immunfluoreszenzfärbung wollen wir die möglichen Komplexpartner durch pull down assays mit anschließender MALDI TOF/MS und nativer 2D Gelelektrophorese isolieren und analysieren. Durch die hohe Spezifität und Bindungskapazität des Antikörpers ist es auch möglich direkt SPO11/DNA-Komplexe zu isolieren und diese durch next generation sequencening zu analysieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen