Characterization of microRNA-protein complexes involved in Hepatitis C Virus translation regulation by the liver-specific microRNA-122

• Antragsteller: Professor Dr. Michael Niepmann
• Fachliche Zuordnung: Virologie
• Förderung: Förderung von 2009 bis 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 92854978

Dieses Projekt beschäftigt sich mit der Analyse der Funktion der leberspezifischen microRNA-122 (miR-122) bei der Regulation der Translation und Replikation von Hepatitis C Virus (HCV) sowie der Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Komponenten der beteiligten microRNA/protein (miRNP)-Komplexe. In der bisherigen Förderperiode haben wir gezeigt, dass Argonaute (Ago) 2 Protein an der Stimulation der Translation von HCV beteiligt ist. Ago2 interagiert mit der HCV 5´-Untranslatierten Region (5´-UTR) vor der Internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) spezifisch in Anwesenheit der miR-122. In Kaninchen-Retikulozyten-Lysat stimulieren nur einzel¬strängige RNA-Oligonukleotide die HCV-Translation durch Verdrängung einer weitreichenden inhibitorischen RNA-RNA-Interaktion in der HCV RNA. In Zellen dagegen stimulieren nur Duplex-miR-122-Vorläufer korrekter Länge die HCV-Translation, was darauf hindeutet, dass eine zelluläre Maschinerie die Duplex-miRs entwindet und dabei ihre Länge misst. Diese Stimulation findet überwiegend während der G0, G1 und G2/M-Phasen, aber weniger in der S-Phase des Zellzyklus statt. Erste Versuche der Identifizierung anderer Protein-Komponenten der miR-122/Protein-Komplexe führten zur Identifizierung des Heat shock cognate protein 70 (Hsc70), dessen Bindung an die HCV-RNA durch die miR-122 kompetiert wird. In der beantragten nächsten Förderperiode wollen wir die miR-122/Ago-miRNP-Komplexe mit der HCV-RNA weiter charakterisieren bezüglich ihrer Funktion und der exakten Rolle der Ago-Proteine in diesen Komplexen sowie weitere miRNP-Komponenten und ihre Interaktionen charakterisieren. Insbesondere konzentrieren wir uns dabei auf folgende Ziele: 1. Charakterisierung möglicherweise unterschiedlicher Funktionen der beiden miR-122-Bindungsstellen bei der RNA-Stabilisierung und Stimulation der Translation, 2. Analyse einer möglichen Doppelrolle von Ago2 in den miRNP-Komplexen, 3. Möglicher Austausch von Ago2 durch Ago1 und 3 in den miRNP-Komplexen, 4. Identifizierung weiterer Komponenten der HCV/miR-122/Protein-Komplexe durch SILAC-Proteomics, und 5. Funktionelle Interaktionen der Protein-Komponenten in den HCV/miR-122/Protein-Komplexen (einschließlich einer möglichen Rolle von Hsc70). Dazu arbeiten wir bezüglich Ago-RNA-Interaktionen mit G. Meister (Regensburg) und bezüglich Massenspektrometrie mit G. Lochnit (Gießen) zusammen. Die Analyse der Komponenten der miRNP-Komplexe und ihrer Funktionen soll die molekularen Details der Wirkung von miR-122 bei der HCV-Replikation aufdecken und so auch zum besseren Verständnis des Lebertropismus von HCV beitragen. Außerdem könnte die möglicherweise duale Funktion der eng benachbarten miRNP-Komplexe auf der HCV-RNA neue Aspekte der unterschiedlichen Funktionen von microRNA-Protein-Komplexen im Allgemeinen aufzeigen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen