Herstellung einer dreidimensionalen chondrokondukiven Kollagenmatrix aus porcinen Menisken.
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel des vorliegenden Projekts war es, porcines Meniskusgewebe durch einen nasschemischen Prozess so weit zu reinigen, dass es ohne entzündliche Reaktionen hervorzurufen als Transplantatmaterial in der Humanchirurgie eingesetzt werden kann. Das Material sollte außerdem seine Chondrokonduktivität nicht verlieren, durch xenogene Chondrozyten revitalisierbar sein, Zellmigration sowie eine Neubildung meniskuspezifischen extrazellulären Matrixmaterials durch xenogene Chondrozyten, das essentiell für die Meniskuseigenschaften ist, begünstigen. Diesen Forderungen konnte mit einem siebenstufigen Reinigungsprozess nachgekommen werden. Mit diesem Prozess konnten unter Erhalt der natürlichen 3D-Kollagenstruktur Keime, zellulären Bestandteile und entzündungsrelevante Determinanten so weit reduziert werden, wie es für ein Transplantatmaterial notwendig ist. Zentral sind dafür zwei alkalische Behandlungen mit NaOH sowie je eine Behandlung in Guanidiniumchlorid und Wasserstoffperoxid. Die Parameter der einzelnen Schritte wurden so weit optimiert, dass ein größtmöglicher Reinigungseffekt ohne signifikante Schädigung der für die strukturellen Eigenschaften des Meniskus essentiellen Kollagenmatrix resultiert. Für eine biologische Beurteilung des Matrixmaterials wurde ein in w/ro-Zytotoxizitätstestsystem nach ISO-Standards etabliert und durchgeführt. In diesem Testsystem sind selbst nach Sensibilisierung keine zytotoxischen Effekte der Kollagenmatrix auf verschiedene Indikatorzellen festgestellt worden. Um das gewonnene Matrixmaterial weiter zu charakterisieren, wurden Besiedelungsversuche mit xenogenen Zellen durchgeführt. Dazu wurden primäre bovine Meniskusfibrochondrozyten reproduzierbar isoliert und unter optimalen Kulturbedingungen amplifiziert. Alle Besiedelungsversuche belegen eine sehr gute Akzeptanz und mit bis zu 112 d Kultivierungsdauer die langfristige Revitalisierbarkeit der prozessierten Kollagenmatrix. Die chondrokonduktiven Eigenschaften der Kollagenmatrix und damit die besondere Qualität und Eignung der Kollagenmatrix als Bioimplantat werden belegt durch Neusynthese meniskusspezifischer EZM, hohe nachgewiesene Zelldichten sowie Zelimigration in die Matrix. Auch innerhalb der Kollagenmatrix gewährleistet die aufgelockerte, natürliche 3D- Struktur eine adäquate Nährstoffversorgung, wie die Färbbarkeit von Zellkernen und die von diesen Zellen nach bis zu 112 d Kultivierungsdauer neugebildete EZM zeigen. Die hervorragende Besiedelbarkeit und die beobachtete Zellmigration weist zudem auf den Erhalt wichtiger Erkennungssequenzen für die Zelladhäsion und -migration auf der Kollagenmatrix nach dem nasschemischen Prozess hin. Aus biologischer Sicht besitzt die hergestellte Kollagenmatrix daher, wie alle Untersuchungen belegen, in vitro sehr gute chondrokonduktive Eigenschaften und eine ausgezeichnete biologische Verträglichkeit. Im Falle einer Transplantation ist deshalb aufgrund der bisher erhobenen Daten davon auszugehen, dass die Kollagenmatrices schnell und effektiv durch körpereigene Zellen besiedelt und durch extrazelluläre Matrix modifiziert werden können. Abschließend wurde untersucht, ob durch eine Druckbelastung während der Kultivierung besiedelter Matrices, ähnlich wie sie in vivo im Knie auftritt, vor allem die Migration der Zellen in die Matrix gefördert werden kann. Obwohl zu dieser Fragestellung bisher nur initiale Versuche durchgeführt werden konnten, zeichnet sich jedoch ab, dass dies nur eingeschränkt der Fall ist. Bei Experimenten mit besiedelten Matrices, die außerhalb des Reaktors vorkultiviert wurden, ergab sich eine gute Einwanderung, wenn das Matrixmaterial vorher künstlich aufgelockert worden war. Es wurde beobachtet, dass sich initial adhärlerte Zellen im Reaktor nicht auf der freiliegenden Matrixoberfläche etablieren konnten. Daraus ist der Schluss zu ziehen, dass nach Transplantation das Knie zunächst zu schonen ist, um eine Besiedlung der Matrix durch humane Zellen zu begünstigen und so die Entwicklung neuen extrazellulären Matrixmaterials zu gewährleisten, was für die Belastung des neuen Meniskus ausschlaggebend sein wird.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Decellularized Cartilage Matrix as a Novel Biomatrix for Cartilage Tissue-Engineering Applications. Tissue Engineering: Part A 2012;18
Schwarz, S., Körber, L., Elsaesser, A. F., Goldberg-Bockhorn, E., Seitz, A. M., Dürselen, L., Ignatius, A., Walther, P., Breiter, R., and Rotter, N.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1089/ten.tea.2011.0705)
