Einfluss der Apoptose auf die epitheliale Dysfunktion und Inflammation in der Pathogenese der traumainduzierten septischen akuten Lungenschädigung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In der ersten Förderperiode wurde die Bedeutung aktivierter neutrophiler Granulozyten (PMN) und der Lungenepithelzellapoptose als Pathomechanismen für die Entstehung einer akuten Lungenschädigung (ALI) durch depletierende Antikörper sowie Knock-out Mäuse in einem neuen, klinisch relevanten, „Double-hit“ Mausmodell bestehend aus Thoraxtrauma und polymikrobieller Sepsis überprüft. In fortführenden Versuchen wurde das therapeutische Potential der antiapoptotischen Behandlung durch die Applikation von „small interfering RNA“ in vivo, untersucht. Darüber hinaus wurden neue Erkenntnisse gewonnen, dass es durch proapoptotische Proteasen (Cathepsin-D, Granzyme-B) in der frühen Phase nach Gewebetrauma möglicherweise direkt zu einer Aktivierung des Complementsystems kommt und so neue Möglichkeiten für mechanistische Studien und therapeutische Interventionen aufgezeigt. Die Versuche zeigten, dass es nach PMN-Depletion zu einer Abmilderung der traumainduzierten septischen ALI kommt. Durch Experimente mit Fas-Mutanten und TNF-Rezeptor-1 Knockout Mäusen konnte die Bedeutung der extrinsischen Apoptose im Rahmen eines klinisch relevanten „Double-hit“ Modells der direkten ALI nachgewiesen werden. Die positiven Effekte beruhten hierbei sowohl auf einer Hemmung der Apoptose, als auch auf einer antiinflammatorischen Wirkung, welche auf einer bis dato wenig untersuchten Aktivierung inflammatorischer Signaltransduktionskaskaden durch Todesrezeptoren basiert. Die in vitro Ergebnisse identifizierten diesbezüglich die Aktivierung von ERK1/2 und MEK als relevanten Pathomechanismus. In vivo Versuche mit antiapoptotischer siRNA gegen Fas, FADD (Fas associated death domain) und Caspase-3 erbrachten Schlüsselinformationen zur Rolle der Lungenepithelzellen in der Entwicklung der ALI, da im Gegensatz zur Verwendung o.g. genetisch modifizierter Tiere ein selektiver antiapoptotischer Effekt in der Epithelzelle erzielt wurde. Es ergab sich, dass durch eine auf Lungenepithelzellen fokussierte Herunterregulation von Fas/FADD bzw. nachfolgender Schlüsselmoleküle (Caspase-3), eine signifikante Abmilderung der ALI erreicht wurde. Allerdings zeigten unsere Ergebnisse auch, dass durch eine einzelne postexpositionelle Intervention nicht die gewünschte Hemmung erreicht wurde, sondern hierzu mehrfache Applikationen notwendig waren. Eine wesentliche Erkenntnis begründet sich auf den Versuchen zum sequentiellen Silencing der Fas Sigaltransduktion. Hier zeigte sich, dass vor allem die Inhibition des Downstream Signalings via Caspase-3 siRNA gegenüber dem upstream signaling Vorteile in der Effektivität zeigte. Die Untersuchungen zum alternativen Zelltod Nekroptose ergaben entscheidende Hinweise, die auch für das Design einer klinischen Arzneimittelstudie von Relevanz sind. Vor allem die Rolle des in zahlreiche Signalwege involvierten Multiadapterproteins RIPK1 (Receptor Interacting Protein Kinase 1) in einem klinisch relevanten Modell der traumainduzierten septischen Lungenschädigung wurde beleuchtet. Der Knockdown von RIPK1 wurde erfolgreich auf Zellebene etabliert, mit ausgeprägten Silencingeffekten auf mRNA- (messenger Ribonucleic acid) und Proteinebene. Im Tiermodell konnte das RIPK1 Silencing in den Lungenepithelzellen auf mRNA Ebene nach 12 h und immunhistochemisch zu beiden Messzeitpunkten bestätigt werden. Weiterhin konnte erstmalig gezeigt werden, dass nach Thoraxtrauma und Sepsis zum 12 h Zeitpunkt erhöhte RIPK1 mRNA Werte in der Lunge vorliegen. Die Applikation von RIPK1 siRNA führte zu einer lokalen und systemischen Suppression der Zyto- und Chemokinausschüttung in Lungengewebe, Blutplasma und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit. Die Schädigung der alveolokapillären Barriere nach Double-Hit blieb durch RIPK1 siRNA jedoch unbeeinflusst. Somit wurde gezeigt, dass RIPK1 in Alveolarepithelzellen pathogenetisch in die Entstehung der Inflammation während der traumainduzierten septischen Lungenschädigung involviert ist. Die Tatsache, dass eine Verminderung der Inflammation nicht in einer Besserung der Lungenschädigung resultierte, spricht dafür, dass der apoptotische Zelltode den prädominanten Schädigungsmechanismus in der traumainduzierten septischen akuten Lungenschädigung darstellt. Bisher blieb unbeantwortet, ob die Inhibition der Apoptose bei der traumainduzierten septischen ALI protektiv durch die Bewahrung der Integrität der alveolokapillären Barriere oder durch die Reduktion von apoptotischen Zellmaterial in der Lunge wirkt. Es war ebenfalls unklar welche Rolle die traumainduzierte Akkumulation von nekrotischem Gewebe in der Lunge, z.B. nach direktem Thoraxtrauma, immunologisch bedeutet. Diesbezüglich belegen unserer Ergebnisse, dass die Instillation von vitalen oder apoptotischen Zellen in die gesunde Lunge der Versuchstiere keine zusätzlichen immunologisch erfassbaren Effekte induzierte. Die Instillation von nekrotischen Zellen/ Gewebe führte jedoch zu Veränderungen des Chemokin-/Zytokinprofils in der BAL. Um mögliche additive Effekte in der vorgeschädigten Lunge zu untersuchen, wurde die Instillation des nekrotischen Lungengewebes im Anschluss an einen thoraxtraumainduzierten septischen Lungenschaden durchgeführt. Dabei wurde insgesamt eine Verstärkung des Lungenschadens auf Ebene der untersuchten Entzündungsparameter in der Lunge festgestellt (v.a. für MIP-2 und G-CSF), wohingegen dieser Effekt in der BAL und dem Plasma nicht zu beobachten war. Abschließend wurde eine geringe (1x10^4) oder eine hohe (1x10^7) Zellzahl apoptotischer oder nekrotischer MLE12 Zellen vier Stunden nach Thoraxtrauma und somit 20 Stunden vor CLP instilliert. Insgesamt zeigte sich vor allem für die gesunde Lunge eine ausgesprochen große Toleranz gegenüber apoptotischen und nekrotischem Zellmaterial, auch in höheren Konzentrationen. Allerdings deutet die durchaus konträre Beeinflussung der Entzündungsmediatoren im Rahmen der akuten septischen ALI durch apoptotische gegenüber nekrotischen Zellinstillaten darauf hin, dass hier unterschiedliche inflammtorische Signlatransduktionskaskaden angesteuert werden. Somit scheint die protektive Wirkung antiapoptotischer siRNA bei traumainduzierter septischer siRNA vor allem auf der Bewahrung der Integrität der alveolokapillären Barriere zu beruhen. Hierauf können sich zukünftige klinische Studien fokussieren. Auch die klinisch zu adressierenden Signaltransduktionsmoleküle sind durch die Ergebnisse des Emmy Noether Programms nun benannt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Pathogenesis of indirect (secondary) acute lung injury. Expert R Respir Med. 2011 Feb;5(1):115-26
Perl M, Lomas-Neira J, Venet F, Chung CS, Ayala A
- Cathepsin D is released after severe tissue trauma in vivo and is capable of generating C5a in vitro. Mol Immunol. 2012 Feb;50(1-2):60-5
Huber Lang M, Denk S, Fulda S, Erler E, Kalbitz M, Weckbach S, Schneider M, Weiss M, Kanse S, Perl M
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.molimm.2011.12.005) - Divergent effects of activated neutrophils on inflammation, kupffer cell/splenocyte activation and lung injury following blunt chest trauma. Shock. 2012 Feb;37(2):210-8
Perl M, Kieninger M, Huber-Lang M, Gross HJ, Bachem MG, Braumüller S, Gebhard F, Ayala A, Knöferl MW
(Siehe online unter https://doi.org/10.1097/SHK.0b013e31823f1776) - Granzyme B: a new crossroad of complement and apoptosis. Adv Exp Med Biol. 2012;946:135-46
Perl M, Denk S, Kalbitz M, Huber-Lang M
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/978-1-4614-0106-3_8) - Role of activated neutrophils in chest trauma induced septic ALI. Shock. 2012 Jul;38(1):98-106
Perl M, Hohmann C, Denk S, Kellermann P, Lu D, Braumüller S, Bachem MG, Thomas J, Knöferl MW, Ayala A, Gebhard F, Huber-Lang MS
- The influence of coagulation and inflammation research on the improvement of polytrauma care. Eur J Trauma Emerg S. 2012 June; 38(3):231-9
Perl M, Huber-Lang M, Gebhard F
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00068-011-0159-5) - Apoptotic and inflammatory signaling via Fas and tumor necrosis factor receptor I contribute to the development of chest trauma-induced septic acute lung injury. J Trauma Acute Care Surg. 2013 Mar;74(3):792-80
Weckbach S, Hohmann C, Denk S, Kellermann P, Huber-Lang MS, Baumann B, Wirth T, Gebhard F, Bachem M, Perl M
(Siehe online unter https://doi.org/10.1097/TA.0b013e31827a3655) - Inflammatory and apoptotic alterations in serum and injured tissue after experimental polytrauma in mice: distinct early response compared with single trauma or "double-hit" injury. J Trauma Acute Care Surg. 2013 Feb;74(2):489-98
Weckbach S, Hohmann C, Braumueller S, Denk S, Klohs B, Stahel PF, Gebhard F, Huber-Lang MS, Perl M
(Siehe online unter https://doi.org/10.1097/TA.0b013e31827d5f1b) - Silencing of fas, fas-associated via death domain, or caspase 3 differentially affects lung inflammation, apoptosis, and development of trauma-induced septic acute lung injury. Shock. 2013 Jan;39(1):19-27
Messer MP, Kellermann P, Weber SJ, Hohmann C, Denk S, Klohs B, Schultze A, Braumüller S, Huber-Lang MS, Perl M
- The molecular fingerprint of lung inflammation after blunt chest trauma. Eur J Med Res. 2015 Aug 25;20:70
Ehrnthaller C, Flierl M, Perl M, Denk S, Unnewehr H, Ward PA, Radermacher P, Ignatius A, Gebhard F, Chinnaiyan A, Huber-Lang M
(Siehe online unter https://doi.org/10.1186/s40001-015-0164-y)
