Structure and function of YidC and homologous membrane proteins
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Projekt hatte die YidC Membraninsertase als zentrales Thema wobei eine Struktur- Funktionsanalyse Einblicke in den Mechanismus der Insertase gewähren sollte. Obwohl die YidC/Oxa1/Alb3 Insertasen nur sehr geringe Sequenzkonservierung aufweisen, haben alle eine zentrale Domäne mit 5 Transmembran-Helices (TMs) essentiell für die Insertase-Funktion. Die N- und C-Termini variieren und haben vermutlich individuelle Funktionen. Zu Beginn des Projektes war weder der Mechanismus der Membranprotein-Insertion durch YidC noch dessen Struktur bekannt. Ausgehend von E. coli YidC, wurde zunächst die periplasmatische Domäne (P1D) eingehend untersucht und eine 1.8Å Struktur gelöst. P1D zeigt eine super-β-sandwich Struktur ähnlich zu zuckerbindenden Proteinen und eine C-terminale linker region, die vermutlich an Lipide bindet. Die funktionelle Rolle der P1D ist nicht geklärt, aber es gibt Hinweise, dass sie bei der Faltung periplasmatischer Domänen in Substrat-Proteinen beteiligt ist. Da wir relativ schnell Kristalle verschiedener YidC Varianten erhalten hatten, wurde ein umfangreicher Screen von YidC (Oxa1 und Alb3) aus verschiedenen Organismen durchgeführt. Motiviert durch den Erfolg von Fusionsproteinen in der Strukturanalyse von GPCRs haben wir die “carrier driven crystallization” bei uns implementiert. Trotz größter Anstrengungen konnten wir unsere Kristalle nicht signifikant verbessern. Wir konnten die entwickelten Protokolle aber äußerst erfolgreich in anderen Projekten anwenden, z.B. für die Interakion von Alb3 mit der Targeting Maschinerie in Chloroplasten (cpSRP43/Alb3). Im Hinblick auf ribosomen-assoziierte Chaperone und Enzyme aus Eukaryonten haben wir uns in der zweiten Fundingperiode auf den “ribosome associated complex” (RAC) fokussiert, der eine zentrale Rolle in der co-translationalen Proteinfaltung spielt (mit R. Beckmann). RAC ist ein Komplex aus dem Hsp70 Protein Ssz und dem Hsp40 Protein Zuotin und bildet am Ribosom mit dem Hsp70 Protein Ssb einen Chaperon Komplex. Die Struktur und Ribosomeninteraktion von RAC wurde durch SAXS, Cryo-EM und Kristallographie untersucht. RAC bindet am Exit-Tunnel und wird durch Interaktion mit dem Expansion Segment 27 der ribosomalen RNA stabilisiert. Da RAC als Co- Chaperon die ATPase-Aktivität von Ssb über die J-Domäne von Zuotin stimuliert, wurden Ssb und RAC näher untersucht. Es konnte eine 3.6Å Struktur von Ssb, sowie ein erster Komplex aus Ssz und Zuotin bei 3.2Å gelöst werden. Diese Strukturen bilden zusammen mit funktionellen Assays die Basis für eine weitergehende Untersuchung dieses einzigartigen Chaperon-Systems. Im Hinblick auf die enzymatische Modifizierung von naszierenden Proteinen am Ribosom sind wir besonders an der Acetylierung interessiert, die in Eukaryonten am häufigsten auftritt. In Hefe sind drei Nα-terminale Acetyltransferase (Nat)-Komplexe beschrieben, die alle am Exit-Tunnel binden. Wir konnten die 3.4Å Struktur eines trimeren NatA komplexes lösen. Die regulatorische Rolle der dritten Untereinheit sowie die Ribosomen-Bindung von NatA werden derzeit eingehend charakterisiert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2008) Purification, crystallization and preliminary structural characterization of the periplasmic domain P1 of the Escherichia coli membrane-protein insertase YidC Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64 Pt 2: 144-148
Ravaud, S., Wild, K. and Sinning, I.
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(2008) The crystal structure of the periplasmic domain of the Escherichia coli membrane protein insertase YidC contains a substrate binding cleft, J. Biol. Chem. 283: 9350-8
Ravaud, S., Stjepanovic, G., Wild, K., Sinning, I.
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(2009) Delivering proteins for export from the cytosol, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10: 255-64
Cross, B.C.S., Sinning, I., Luirink, J., High, S.
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(2009) Signal sequences get active. Nat Chem Biol. 5: 146-7
Sinning, I., Wild, K., Bange, G.
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(2010) cpSRP43 is a novel chaperone specific for light-harvesting chlorophyll a,b binding proteins, J. Biol. Chem. 285: 21655-61
Falk, S. & Sinning I.
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(2010) The C terminus of Alb3 interacts with the chromodomains 2 and 3 of cpSRP43. J. Biol. Chem. 285: le25-6
Falk, S., Sinning, I.
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(2010) The C-terminus of the Alb3 membrane insertase recruits cpSRP43 to the thylakoid membrane, J. Biol. Chem. 285: 5954-62
Falk, S., Ravaud, S., Koch, J., Sinning, I.
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(2011) Mdm38, is a 14-3-3-like receptor that associates with the protein synthesis machinery at the inner mitochondrial membrane. Traffic 12: 1457-66
Lupo, D., Vollmer, C., Deckers, M., Mick, D.U., Tews, I., Sinning, I., Rehling, P.
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(2013) Consistent mutational paths predict eukaryotic thermostability, BMC Evol Biol 13: 7
van Noort, V., Bradatsch, B., Arumugam, M., Amlacher, S., Bange, G., Creevey, C., Falk, S., Mende, D.R., Sinning, I., Hurt, E., Bork, P.
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(2013) Structural characterization of a eukaryotic co-translational chaperone, the ribosome-associated complex (RAC), Nat. Struct. Mol. Biol. 20: 23-8
Leidig, C., Bange, G., Kopp, J., Amlacher, S., Aravind, A., Wickles, S., Witte, G., Hurt, E., Beckmann, R., Sinning, I.
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(2014) Construction of the central protuberance requires roatation of 5S RNP during 60S ribosome biogenesis, Nat. Commun. 5: 3491
Leidig, C., Thoms, M., Holdermann, I., Bradatsch, B., Berninghausen, O., Bange, G., Sinning, I., Hurt, E., Beckmann, R.
