Functional characterization of the ribosomal tunnel exit ligand ERj1
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Der Transport von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) basiert auf aminoterminalen Signalpeptiden in der Polypeptidkette des Vorläufers und einem Translokon in der ER-Membran mit dem Sec61-Komplex als zentrale Komponente. Der Sec61-Komplex stellt sowohl den proteinführenden Kanal als auch den Ribosomenrezeptor für cotranslational arbeitende Translokons dar. Eine Vielzahl ergänzender Faktoren wie OST oder Chaperone der Hsp70- und Hsp40-Proteinfamilien, die an der Vorläuferprozessierung und der Translokation beteiligt sind, ermöglicht den korrekten Transport von Tausenden unterschiedlicher Proteine. Diese ergänzenden Komponenten des Translokons waren im Fokus unserer Untersuchungen im Verlaufe des Projekts. Strukturelle in situ-Einblicke in das Translokon ermöglichte der Einsatz von Kryoelektronenmikroskopie und „single-particle analysis“ und Kryoelektronentomographie in Kombination mit der RNAi-Technologie und lieferte ein detailiertes Bild der räumlichen Gesamtstruktur des nativen Translokons mit den Komplexen Sec61, TRAP und OST. Die präzise Positionierung des offenkundig monomeren OST-Komplexes am cotranslational agierenden Sec61- Translokon erlaubte Rückschlüsse über den molekularen Mechanismus der cotranslationalen N-Glycosylierung. Die Basis für unsere Untersuchungen des ER-membranständigen Hsp40-Chaperons ERj1 lieferten unsere vorausgehenden Beobachtungen, wonach ERj1 auf der cytosolischen Seite mit Ribosomen interagiert und auf der luminalen Seite mit BiP. Um neue Einblicke in diese Interaktionen zu erlangen, wurden Messungen mittels SPR-Spektroskopie durchgeführt. Wir bestimmten die apparente Affinität von ERj1 zu Ribosomen (KD 8 nM). Die simultane Bindung von BiP erniedrigte die Affinität von ERj1 zu den Ribosomen. Das analoge cytosolische Hsp40/Hsp70- Paar MPP11/Hsp70L1 (mRAC) zeigt ein ähnliches regulatorisches Verhalten am Ribosom. MPP11 und mRAC kompetierten jedoch nicht mit ERj1 um die Bindung am Ribosom, somit binden sie das Ribosom nicht an der gleichen Stelle. Im Verlaufe dieses Projekts haben wir das humane ER-Membranprotein Sec62 als einen neuen ribosomalen Liganden identifiziert (KD 0,13 nM). Sec62 und ERj1 haben überlappende Bindungsstellen am Ribosom. Beide benutzen basische Peptidmotive für die Ribosominteraktion und binden an naszierende Ketten. Weiterhin haben wir sowohl eine Ca2+- sensitive Interaktion von Sec62 mit dem Sec61-Komplex als auch eine direkte Interaktion mit dem ER-membranständigen Hsp40 Sec63 gezeigt. Der Einsatz der RNAi-Technologie ermöglichte uns die Charakterisierung von Sec62 und Sec63 als Hilfskomponenten des Sec61-Komplexes beim Import von Proteinen ins ER. Beide Proteine sind sowohl am posttranslationalen Import von kleinen Proteinen als auch am Transport von großen Transportsubstraten beteiligt. Überraschenderweise, werden diese großen Sec62/Sec63-abhängigen Transportsubstrate unabhängig von SRP importiert. Dies suggeriert, dass Sec62/Sec63 Teil eines alternativen substratspezifischen ER-Membrantargeting Systems sind. Im Einklang damit fanden wir eine substratspezifische Beteiligung von Sec63 an der initialen Phase des cotranslationalen Transports von Proteinen ins ER. Wir charakterisierten den BiP-Austauschfaktor Sil1 als ein für die Muskelfunktion der Maus essentielles Protein. Dies ermöglicht die Etablierung der Sil1-Mausmutante woozy als in vivo-Modell für die humane Erkrankung Marinesco-Sjögren-Syndrom. Befunde für Sec62 und Sec63 sind ebenfalls medizinisch relevant. Nucleoredoxin, ein für die Cystogenese wichtiges und am Redoxsensitiven Wnt Signalweg beteiligtes Protein, ist ein neuer Interaktionspartner von humanem Sec63. Wir denken, dass die Sec63/Nucleoredoxin Interaktion eine Rolle bei der Pathogenese der autosomal dominanten polyzystischen Lebererkrankung spielt. Weiterhin identifizierten wir SEC62, welches die Zellmigration beeinflusst, als neuartiges Onkogen bei Prostata- und Lungenkrebs und charakterisierten Sec62 als möglichen diagnostischen und prognostischen Marker für Lungenkrebs. Tumorzellen mit hohem Sec62-Gehalt sind resistenter gegen Thapsigargin-induzierten ER-Stress. Der Calmodulinantagonist Trifluoperacin beeinflusst die Zellmigration und die Thapsigargininduzierte ER-Stresstoleranz. Dies erlaubt es zukünftig ein personalisiertes therapeutisches Konzept für Patienten mit Sec62-überproduzierenden Tumoren zu etablieren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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