Massenphotometer-Massendurchfluss-Hochkonzentration System

• Fachliche Zuordnung: Grundlagen der Biologie und Medizin
• Förderung: Förderung in 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 550111075

Ziel des Antrags ist es, die routinemäßige, schnelle und exakte Untersuchung von unmarkierten Biopolymeren aus Proteinen bzw. DNA mittels Massenphotometrie (MP) in Lösung zu ermöglichen. MP kann die Molekularmasse von Partikeln (Biopolymere) mit einer Masse von 30 kDa bis 5 MDa frei in Lösung in vitro messen. Dieser Massenbereich ist für viele Proteine, DNAs und Ihrer Komplexe geeignet. MP detektiert die Lichtstreuung durch Partikel, die aus einer aus einer Lösung auf einer Glasoberfläche landen. Ähnlich der physiologischen Situation müssen die Biopolymere dazu keine chemischen Modifikationen tragen und nicht an einer Oberfläche immobilisiert werden. MP hat eine Auflösung von ca 2 % der zu bestimmenden Masse. In der hier beantragten Form (inklusive Massendurchfluss-Hochkonzentration-System) arbeitet die MP im nM-µM Konzentrationsbereich, in welchem sich viele Bindungsreaktionen von Biopolymeren stattfinden. MP ist daher geeignet, um Komplexbildungsstudien durchzuführen. Am Antrag sind chemische und molekularbiologische Forschungsgruppen beteiligt. Die Molekularbiologen haben zum Ziel, mittels MP die Bildung und Regulation von Proteinkomplexen, die bei der Vererbung der genetischen Information zentrale Rollen spielen, zu verstehen. Dazu werden Proteinkomplexe, die die mitotische Chromosomenverteilung, und solche, die die DNA Replikation vermitteln und regulieren, erforscht. Ein weiteres Ziel ist die Untersuchung von Proteinkomplexen, die die physiologische Balance der zellulären Proteine (Proteostase) gewährleisten helfen. Die Chemiker wollen mithilfe der MP DNA-Nanostrukturen mittels DNA Origami herstellen sowie biologisch aktive kleine Moleküle in ihrer Wirkung verstehen. Zudem werden kleine Moleküle zur gezielten Proteindegradation in Zellen entwickelt (PROTACs). Für diese Zielsetzungen wird MP zur teils quantitativen Charakterisierung von Protein- und DNA Bindereaktionen eingesetzt. Die Regulation dieser Reaktionen durch Proteinkinasen wird ebenfalls untersucht. Die Chemiker werden mittels MP die DNA-DNA und DNA-Proteinkomplexe als Baueinheiten für größere Nanostrukturen herstellen und testen (DNA Origami). Desweiteren werden sie mittels MP die Wirkung kleiner Moleküle auf die Komplexbildung von Proteinen untersuchen. Bei diesen Studien wird die MP bereits benutzte Techniken teils ersetzen, teils ergänzen. Vorteile der MP ergeben sich durch ihren ressourcenschonenden Charakter im Vergleich zu den bisher benutzten Größenausschlusschromatographie und zur isothermalen Kalorimetrie. Im Vergleich zu klassischen Affinitätspulldownexperimenten und Surface Plasmon Resonance Messung benötigt MP keine Modifikationen in Form von Proteintags und keine Immobilisierung der Biolpolymere. Die schnelle ressorcenschonende MP erlaubt zudem Routineanwendungen zum Optimieren von Pufferbedingungen und für Qualitätstests von Proteinpräparationen.

• DFG-Verfahren: Forschungsgroßgeräte
• Großgeräte: Massenphotometer-Massendurchfluss-Hochkonzentration System
• Gerätegruppe: 5200 Photometer, Absorptionsphotometer (außer Spektralphotometer 180-186)
• Antragstellende Institution: Universität Duisburg-Essen
• Leiter: Professor Dr. Dominik Boos