Assemblierung und Dynamik einer bakteriellen DNA-Aufnahmemaschinerie auf Einzelmolekülebene

• Antragsteller: Professor Dr. Peter Graumann
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Mikrobielle Ökologie und Angewandte Mikrobiologie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 549961924

Natürliche Kompetenz beschreibt die Fähigkeit einiger Bakterien aktiv DNA aus der Umwelt aufzunehmen und durch RecA gesteuerte homologe Rekombination (HR) in ihr Genom einzubauen. Kompetenz ist eine wichtige Quelle für den DNA-Austausch zwischen Bakterien und führt zur Verbreitung von Antibiotikaresistenzen, daher ist der Prozess von großer Bedeutung für die Evolution und für die menschliche Gesundheit. Wir haben gezeigt, dass der Modellorganismus Bacillus subtilis kompetenzspezifische Pili exprimiert, um DNA auf der gesamten Oberfläche aufzunehmen. Diese kann sich über das DNA-bindende Protein ComEA im Periplasma ausbreiten und wird dann von einem Proteinkomplex, der sich an einem Zellpol befindet, in ssDNA umgewandelt und in das Cytosol transportiert. Die DNA-Aufnahme ist also ein zweistufiger Prozess, bei dem der Transport durch die Zellwand von der polaren Aufnahme in das Zytosol abgekoppelt wird. Während das Bild des Weges der DNA langsam Gestalt annimmt, bleiben noch einige wichtige Fragen offen. Kompetenz-Pili in einigen Bakterien können an dsDNA binden, aber es ist unklar, wie dsDNA durch einen engen Kanal passen würde, da ihre Biegesteifigkeit es nicht erlauben würde, dsDNA in der Mitte des langen Moleküls gebunden einzuziehen. Es ist auch unklar, wie ssDNA, die in das Zytosol transportiert wird, stabil in das Genom eingeführt wird. Wir haben kürzlich gefunden, dass das Hauptpilin ComGC sowohl an dsDNA als auch an ssDNA binden kann. Die ssDNA-Bindung würde erklären, wie DNA aufgenommen werden kann, da ssDNA-Teile langer dsDNA-Moleküle leicht gebogen und durch einen Piluskanal geschleust werden könnten. Wir planen, diesen Punkt zu beweisen, indem wir die ssDNA- und dsDNA-Bindung gereinigter Piline charakterisieren und ihre Bindungsoberflächen identifizieren. Wir werden versuchen, die 3D-Strukturen aller Piline zu lösen und die Struktur der Kompetenz-Pili mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie und der Elektronenmikroskopie zu analysieren, um einen Einblick in ihre molekulare Wirkungsweise zu erhalten. Wir stellen die Hypothese auf, dass in das Zytosol aufgenommene ssDNA über zwei Proteine, DprA und ComFC, für die Bindung an RecA verfügbar gemacht wird, so dass RecA effizient Protein/ssDNA-Filamente bilden kann, die ssDNA in das Chromosom integrieren. Unsere jüngsten Analysen zeigen, dass die putative DNA-Endonuklease CoiA eine wichtige Rolle bei der Transformation in spielt und die fehlende Crossover-Resolvase sein könnte. CoiA ist an den Zellpolen lokalisiert und wandert nach Zugabe von DNA auf die Nukleoide, um als letzter Schritt der HR zu fungieren. Durch einen kombinierten biochemischen/zellbiologischen/genetischen Ansatz werden wir den Weg der ssDNA in das Chromosom klären. CoiA ähnelt Proteinen mit unstrukturierten N- und C-Termini und könnte ein Kandidat für einen Phasentrennungsprozess während der DNA-Rekombination sein, den wir testen werden. Die geplanten Experimente werden das Bild der natürlichen Transformation vervollständigen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen