Aufklärung des Ursprungs und der Evolution der Stickstofffixierung durch die Wiederbelebung von anzestralen Nitrogenasen

• Antragsteller: Johannes Rebelein, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 547781599

In diesem Projekt werde ich den Ursprung und die Evolution der Stickstofffixierung durch Nitrogenasen aufklären. Obwohl alle Lebensformen bioverfügbaren Stickstoff benötigen, um zentrale Metaboliten wie Nukleotide und Aminosäuren aufzubauen, scheint die Natur das Stickstofffixierungsproblem nur einmal während der Evolution gelöst zu haben. Nitrogenasen sind die einzigen bekannten Enzyme, die in der Lage sind, die inerte Dreifachbindung von molekularem Stickstoff (N2) zu brechen und bioverfügbaren Stickstoff (Ammoniak) zu produzieren. Hier werden wir den Ursprung der Stickstofffixierung nachverfolgen, indem wir Nitrogenasen aus der Vergangenheit mittels der Rekonstruktion von anzestralen Sequenzen wiederbeleben. Wir werden den letzten gemeinsamen Vorfahren der ältesten Nitrogenase, der Molybdän (Mo)-Nitrogenase, und den letzten gemeinsamen Vorfahren der Nitrogenase-Maturasen wiederbeleben, um Aminosäuren, die für die Katalyse und Reifung essentiell sind, zu identifizieren. Anschließend werden wir den Nitrogenase-Vorfahren in eine katalytische Mo-Nitrogenase und eine spezifische Maturase umwandeln. Die Umwandlung eines Nicht-Nitrogenase-Enzyms in eine echte Nitrogenase wird uns neue Einblicke in den umstrittenen Nitrogenase-Mechanismus ermöglichen. Darüber hinaus werden wir die folgenden Fragen beantworten: i) Wie sah der Metallocluster und das aktive Zentrum des Nitrogenase-Vorgängers aus? ii) Welche Aminosäuremutationen verwandeln ein Nicht-Nitrogenase-Enzym in eine katalytische Nitrogenase oder eine spezifische Maturase? iii) Was sind die bestimmenden strukturellen Prinzipien von Nitrogenasen und Nitrogenase-Maturasen? Die vorgeschlagene Forschung beleuchtet eines der bedeutendsten Ereignisse in der biologischen Geschichte: die Evolution von Nitrogenasen aus nicht-stickstofffixierenden Enzymen. Um dies Fragen zu beantworten werden wir die anzestralen Sequenzen in dem von uns etablierten Plasmid-basierten Nitrogenase-Expressionssystem in Rhodobacter capsulatus exprimieren, screenen und anaerob aufreinigen. Die anzestralen Nitrogenasen werden katalytisch mittels Gaschromatographie und photometrischen Aktivitätsassays, strukturell mittels kryogener Elektronenmikroskopie und Kristallographie als auch spektroskopisch mittels Elektronenspinresonanz-Spektroskopie analysiert um ein umfassendes Verständnis der Enzyme zu erhalten. Mit diesen Studien werden wir erste Einblicke in die Evolution dieser hochreaktiven und komplexen Metalloenzyme gewinnen. Wir werden die Struktur und Aktivitäten verschiedener ursprünglicher Metallokofaktoren sowie die Rolle einzelner Aminosäuren bei der Stickstofffixierung und der Cluster-Maturation entschlüsseln um eine umfassende Übersicht über die Struktur-Funktions-Beziehung zu erhalten. Wir werden neue Erkenntnisse über den umstrittenen Nitrogenase-Mechanismus gewinnen und möglicherweise die Frage beantworten, warum die Natur das Stickstofffixierungsproblem nur einmal während der Evolution gelöst hat.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen