Struktur-Funktionsanalyse von γ-TuRC-Regulation und -Targeting durch NEDD1-CEP192, CM1-Motiv und NME7

• Antragsteller: Dr. Stefan Pfeffer; Professor Dr. Elmar Schiebel
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 547269389

Mikrotubuli (MTs) sind dynamische Tubulinpolymere mit wesentlichen Funktionen bei Chromosomensegregation, Zellpolarität und intrazellulärem Transport. MTs werden durch die Wirkung des gamma-Tubulin-Ringkomplexes (gamma-TuRC) an definierten Stellen der Zelle aus Tubulin-Untereinheiten assembliert. Trotz entscheidender Bedeutung für verschiedene Funktionen und die Lebensfähigkeit von Zellen sind die molekularen Mechanismen, die der Kontrolle der γ-TuRC Aktivität durch Regulatoren und Targetingfaktoren unterliegen, größtenteils unbekannt. Basierend auf umfangreichen Vorarbeiten und unserer belegten Erfahrung in der strukturellen Analyse von γ-Tubulin Komplexen schlagen wir hier Experimente vor, die diese Lücke schließen. NEDD1 ist ein essentieller Targetingfaktor des γ-TuRC, der für γ-TuRC Rekrutierung ans Centrosom und die Entstehung der mitotischen Spindel von zentraler Bedeutung ist. Unsere strukturellen Vorarbeiten deuten darauf hin, dass NEDD1 als Tetramer an die Spitze des γ-TuRC-Kegels bindet. Wir werden dieses Modell verfeinern und testen, indem wir die Interkation bei höherer Auflösung abbilden und zentrale NEDD1-γ-TuRC-Interaktionen biochemisch rekonstruieren und analysieren. Zudem werden wir die funktionellen Konsequenzen der Störung einzelner Bindestellen in Zellen testen. NME7 ist eine Kernkomponente und ein Regulator des γ-TuRC. Unsere strukturellen Vorarbeiten deuten darauf hin, dass NME7 an eine Insertionsdomäne der γ-TuRC-Untereinheit GCP6 bindet und dadurch die γ-TuRC Konformation allosterisch reguliert. Um den Mechanismus genauer zu verstehen werden wir die Auflösung unserer cryo-EM Strukturen des γ-TuRC mit und ohne NME7 verbessern und die MT-Nukleationsaktivität mutierter NME-defizienter γ-TuRCs in vitro und in vivo analysieren. Das CM1 Motiv-enthaltende Protein CDK5RAP2 ist ein wichtiger Aktivator des γ-TuRC. Unsere Vorarbeiten zeigen, dass die Struktur des γ-TuRC mit einem physiologischen Set an Interaktionspartnern in aufgereinigten menschlichen Centrosomen mittels Kryo-Elektronentomographie abgebildet werden kann. Dieser Ansatz ermöglicht es uns aus einer strukturellen Sichtweise heraus zu analysieren wie CDK5RAP2 und CEP192-NEDD1 die Struktur, Aktivität und das Targeting des γ-TuRC ans Centrosom beeinflussen. Wir werden verschiedene CM1 Motiv-enthaltende Proteine, NEDD1 und CEP192 in Zellen depletieren und analysieren welche Effekte diese Depletionen auf die Struktur, Konzentration, Aktivität und Funktion des γ-TuRC in aufgereinigten Centrosomen und Zellen haben. Zusammenfassend wird dieser Antrag mithilfe einer Kombination aus Biochemie, Zellbiologie und Strukturbiologie zentrale offene Fragen zur Struktur, Funktion und Integration wichtiger regulatorischer Proteine der γ-TuRC-vermittelten MT-Nukleation beantworten und damit einen fundamentalen Aspekt des Lebens behandeln.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen