Untersuchungen zur Regulation der am Chlorophyll-Abbauweg beteiligten Enzyme
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In diesem Projekt zur Regulation des Chlorophyllabbaus wurde zur Klärung beigetragen, inwieweit die Enzyme Phäophorbid-a-Oxygenase (PaO) und Rote-Chlorophyll-Katabolit- Reduktase (RCCR) an der Regulation und Induktion des Katabolitstoffwechsels des Chlorophylls beteiligt sind. 1. Anfänglich wurden in Tabak in einer gnjndlegenden Analyse die Expression und Aktivität am Chlorophyllabbau beteiligter Enzyme in einem Gradienten vom jüngsten bis zum seneszenten Blatt durchgeführt. Dazu wurden Mengen an Transkripten und Proteinen des Chlorophyllabbaus sowie deren Aktivitäten und die steadystate Gehalte der Chlorophyllkatabolite im Verlauf der Blattentwicklung bestimmt. Es zeigte sich interessantenweise mit einleitender Seneszenz ein fortschreitender intensiver Chlorophyllabbau, der jedoch nicht mit den in-vitro Aktivitäts- und Expressionsprofilen unbedingt korrelierte. Andere Faktoren beeinflussen den Beginn des sichtbaren Chlorophyllabbaus nach Seneszenzbeginn (Eckhardt et al., eingereicht). 2. Mit transgenen Tabakpflanzen für die Überproduktion von PaO und RCCR wurde die regulative Rolle beider Enzyme für die Induktion des Chlorophyllkatabolismus untersucht. PaO-Überproduzenten bilden einen nekrotischen Phänotyp aus. In den transgenen Pflanzen, in denen beide Enzyme gleichzeitig überexprimiert werden, bleibt in einigen Linien der Nekrosephänotyp erhalten. In den Überproduzenten akkumulieren jedoch nicht mehr Chlorophyllkatabolite als im Wildtyp, obwohl sich die Verhältnisse an Derivaten der nichtfluoreszierenden Chlorophyllkatabolite in Abhängigkeit zur Expressionsstärke der Transgene verändern. Es zeigte sich, dass das überschüssige Angebot aktiver PaO und RCCR nicht zur Stimulation des Chlorophyllabbaus beiträgt, und somit vermutlich beide Enzyme am Katabolitfluss nicht regulierend eingreifen (Eckhardt et a(., in Vorbereitung). 3. Mit Affinitäts-Tags versehende Proteine des Chlorophyllabbaus wurden in Tabak überproduziert, um mittels Affinitätschromatographie Proteinkomplexe aufzureinigen, die mit den Zielproteinen PaO, RCCR und Chlorophylase verbunden sind. Die bisherigen Aufreinigungen der rekombinanten Proteine aus Piastidenextrakten der ausgewählten transgenen Pflanzen lassen erwarten, dass in Zukunft assoziierte Proteine identifiziert werden können.
