Selektion von Adeno-assoziierten viralen Vektoren zum effizienten und spezifischen Gentransfer in den Herzmuskel nach systemischer Verabreichung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Adeno-assoziierte virale (AAV)-Vektoren sind von apathogenen Parvoviren abgeleitete Gentransfer-Vektoren, die bereits in klinischen Studien unter anderem auch zur Therapie der Herzinsuffizienz eingesetzt werden. Neben der Verwendung geeigneter Promotoren zum gezielten Gentransfer im Herzmuskel oder dem Einsatz spezifischer microRNAs zur Vermeidung von unerwünschter Expression beispielsweise in der Leber kommt der Modifikation der Vektoroberfläche eine zentrale Bedeutung zu, da sie die Passage des Vektors bzw. dessen Genoms von der Blutbahn bis zum Zellkern entscheidend determiniert. Zur Entwicklung von AAV-Vektoren, die sich zum effizienten und spezifischen Gentransfer in den Herzmuskel eignen, haben wir eine randomisierte Peptidbibliothek auf der AAV-Oberfläche exprimiert und zur Selektion gezielt Herzmuskel transduzierender Vektoren eingesetzt. Um Vektoren zu identifizieren, die einen transvaskulären Gentransfer ermöglichen, haben wir die AAV- Bibliotheken intravenös in adulte Mäuse injiziert. Die Herausforderung dieses Ansatzes bestand darin, die in den einzelnen Selektionsrunden in die Herzmuskelzellen aufgenommen Bibliotheksvektoren effizient anzureichern und zu identifzieren. Hierzu haben wir nach Injektion der AAV-Bibliotheken die Herzen entnommen und in 300µm dicken Schnitten in vitro propagiert. Die Überinfektion dieser Schnitte mit Adenoviren führte zur Amplifikation der erfolgreich aufgenommenen AAV-Bibliotheksvektoren, die daraufhin mittels PCR-Techniken weiter angereichert wurden und schließlich zur Sequenzierung und parallelen Herstellung einer weiteren Bibliothek für die nächste Selektionsrunde verwendet werden konnten. Nach drei Runden konnten AAV-Vektoren angereichert, von denen einer effizienter und spezifischer als der Ausgangsvektor Herzmuskelgewebe transduzieren konnte. Die Eignung dieses Vektorsystems zum therapeutischen Gentransfer konnte durch Transfer der intakten ?-Sarkoglykan-cDNA in Mäuse nachgewiesen werden, die aufgrund des Fehlens dieses Gens den Phänotyp einer hereditären Herzmuskelerkrankung (Dilatative Kardiomyopathie) aufweisen. Die systemische Gabe eines AAV-Vektors (AAV2-VNSTRLP) in Mäusen führte zu einer hocheffizienten Genexpression der ?-Sarkoglykan-cDNA im Herzmuskel ähnlich wie mit dem für eine Herzmuskeltransduktion besonders geeigneten AAV-Serotyp 9. Im Gegensatz zu AAV9-Vektoren wies AAV2-VNSTRLP bei fehlender Skelettmuskelexpression eine höhere Spezifität auf. Die Wiederherstellung von ?-Sarkoglykan im Herzmuskel adulter ?- Sarkoglykan-defizienter Mäuse konnte in einer Langzeitstudie die Ausbildung einer Herzinsuffizienz verhindern. Weitere Selektionsrunden auf humanen Herzmuskelzellen bzw. Herzmuskel in Großtiermodellen könnte in Kombination mit geeigneten Applikationsverfahren wie Retroinfusion in Koronarvenen oder Ultraschall-gestützter Destruktion AAV-beladener Mikrosphären zur Entwicklung klinisch einsetzbarer Vektoren führen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Isolation of targeted AAV2 vectors from novel virus display libraries. J Gene Med. 8(11):1307-19. (2006)
Waterkamp DA, Müller OJ, Ying Y, Trepel M, Kleinschmidt JA
- Method of in vivo selection of heart targeting AAV-vectors. AZ 6/940,854 (2007)
Müller OJ, Ying Y, Kleinschmidt JA
- Targeting the heart with gene therapy-optimized gene delivery methods. Cardiovasc Res. 73(3):453-62. (2007)
Müller OJ, Katus HA, Bekeredjian R
- Vectors selected from adeno-associated viral display peptide libraries for leukemia cell-targeted cytotoxic gene therapy. Exp Hematol. 35(12):1766-76. (2007)
Michelfelder S, Lee MK, deLima-Hahn E, Wilmes T, Kaul F, Müller O, Kleinschmidt JA, Trepel M
- Augmentation of AAV- mediated cardiac gene transfer after systemic administration in adult rats. Gene Ther. 15(23):1558-65. (2008)
Müller OJ, Schinkel S, Kleinschmidt JA, Katus HA, Bekeredjian R
- Generation of a highly diverse random peptide library displayed on Adeno-associated virus 9 capsids for selection of AAV9-vectors targeted to human coronary artery endothelial cells. PCT/EP2010/057370 (2009)
Müller OJ, Varadi K, Katus HA, Kleinschmidt JA
- Prevention of cardiomyopathy in ?-sarcoglycan knock-out mice after systemic transfer of targeted adeno-associated viral vectors. Cardiovasc Res. 82(3):404-10. (2009)
Goehringer C, Rutschow D, Bauer R, Schinkel S, Weichenhan D, Bekeredjian R, Straub V, Kleinschmidt JA, Katus HA, Müller OJ
- Successful expansion but not complete restriction of tropism of adeno-associated virus by in vivo biopanning of random virus display peptide libraries. PLoS One. 4(4):e5122. (2009)
Michelfelder S, Kohlschütter J, Skorupa A, Pfennings S, Müller O, Kleinschmidt JA, Trepel M
