Vergleichende Analyse potentiell dysfunktioneller CD8+ T-Zellen gegen Muzin-1 (MUC-1) in dysfunktionaler gesunden Probanden und Patientinnen mit gynäkologischen Tumoren
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Mucine sind große, stark glykosylierte Proteine. Ihre eigentliche Funktion liegt im Schutz empfindlicher Epithelschichten der Lunge, des Gastrointestinaltrakts und der reproduktiven Organe. Die membranständige Form des epithelialen MUC-1 besteht aus einer kurzen cytoplasmatischen und einer transmembranen Domäne, sowie einem langen extrazellulärem Anteil. Dieser beinhaltet 40-80 "Tandem-Repeats" mit jeweils 20 Aminosäuren ("VNTR- Region"). MUC-1 wird auf der Zelloberfläche vieler Adenokarzinome überexprimiert, z.B. auf >95% aller MammaCa. Sezerniertes MUC-1 ist im Serum von MammaCa-Patientinnen mit einer schlechten Prognose und hohem Metastasierungspotenzial assoziiert. Im Gegensatz zum Normalgewebe liegt auf Tumorzellen die tandemartig wiederholte MUC-1-Sequenz deglykosyliert vor, so dass zahlreiche, gegen die immunogene VNTR-Region gerichtete Antikörper bekannt sind. Ursprünglich wurde beschrieben, dass Mucine nur über HLA- unrestringierte T-Zellen erkannt werden können. Spätere Arbeiten zeigten jedoch, dass die VNTR-Region auch Epitope enthält, die über MHC-Klasse-1 präsentiert und von cytotoxzischen T-Zellen (CTL) erkannt werden können. Da bisher von anderen Arbeitsgruppen präexistente MUC-1-spezifische T-Ze|len ausschließlich bei gesunden weiblichen Spendern, die mehrere Schwangerschaften durchlaufen hatten, nachgewiesen wurden, wurde postuliert, dass während der Schwangerschaft eine Immunisierung mit dem MUC-1-Protein, u.U. in Zusammenhang mit der Laktation, erfolgt. Hier wurde spekuliert, dass dies mit ein Grund sein könne, warum ein möglicher Schutz vor Brustkrebs durch Schwangerschaft und Stillzeit existiere. Präexistente MUC-1-spezifische T-Zellen in Tumorpatienten wurden zum Zeitpunkt der Antragstellung noch nicht beschrieben, jedoch konnte vereinzelt gezeigt werden, dass nach Peptidbasierten Vakzinierungen solche nachweisbar waren. Für unsere Analysen benutzten wir zwei HLA-A*0201-bindende Peptidepitope aus MUC-1: "M1.1" (MUC-1950-958, STAPPVHNV) und „M1.2" (MUC-I12.20, LLLLTVLTV), wobei bisher letzteres als „immundominant" beschrieben wurde. Wir konnten zunächst zeigen, dass HLA- restringierte MUC-1-spezifische T-Zellantworten in Gesunden nicht Geschlechts-abhängig oder (nur) durch Schwangerschaft induzierbar sind, da wir diese regelmäßig sowohl in männlichen gesunden Spendern ais auch in gesunden Frauen ohne durchlaufende Schwangerschaften nachweisen konnten. Auffallend war hier, dass die T-Zellantworten fast nur gegen das Ml.l-Epitop gerichtet waren, das zuvor als nicht immundominant eingeschätzt war. Bisher sind präexistente TAA-spezifische T-Zellen in Gesunden so häufig nur für Melan-A beschrieben worden. In Brustkrebspatientinnen konnten in 43% der Fälle präexistente (d.h. es erfolgte zuvor keine Vakzinierung) MUC-1-spezifische T-Ze!len nachgewiesen werden (auch nahezu ausschließlich gegen M1.1). Dies korrelierte nicht mit der Anzahl der Schwangerschaften der Patientinnen, d.h. brustkrebserkrankte Multipara zeigten nicht häufiger MUC-1-spezifische T- Zellen als Nullipara. Es wurde dagegen ein Zusammenhang mit dem Krankheitsverlauf gesehen: MUC-1-spezifische T-Zellen wurden eher zum Zeitpunkt der Primärdiagnose bei geringerer Tumorlast und vor Beginn der adjuvanten Therapie nachgewiesen. In Patientinnen mit Metastasen waren wesentlich seltener MUC-1-spezifische T-Zellen detektierbar, und dann z.B. in Patientinnen mit nicht-viszeraler Metastasierung ohne vorherige Chemotherapie. Daraus schließen wir, dass präexistente TAA-spezifische T-Zellen vom Krankheitsstadium und potentiell immunsuppressiven Therapien beeinftusst werden. Hinsichtlich ihrer Funktion zeigten diese MUC-1-spezifischen T-Zellen zwar eine Freisetzung von Interferon (INF)-y, nicht aber von Granzym B. Dies unterschied sie von parallel getesteten T-Zelien gegen virale „RecaH"-Antigene, die neben INF-y auch meist das stärker mit lytischen Funktionen verknüpfte Granzym B produzierten. Hier kann auf eine eingeschränkte Funktion präexistenter MUC-1-spezifischer T-Zellen geschlossen werden. Zur weiteren Subpopulationsanalyse MUC-1-spezifischer T-Zellen sollten entsprechend spezifische Tetramere herangezogen werden. Dies enwies sich als problematisch, da die zu analysierenden Epitope in der Tetramersynthese zu instabilen Produkten und so teilweise zu unzuverlässigen Ergebnissen führten. Dies und die Tatsache, dass sowohl in Gesunden als auch in Brustkrebspatientinnen kaum T-Zellen gegen MI.2 gefunden wurden, veranlasste uns, die benutzten Epitope an den HLA-A*02-Ankerpositionen zu modifizieren um bessere Bindungsaffinitäten zu erzielen. Diese Epitopvarianten wurden mit verschiedenen Techniken zur Stimulation spezifischer T-Zellen herangezogen {in vitro „priming"), die Kreuzreaktionen gegen die unmodifizierten Ausgangsepitope zeigten. In einer z.Zt. noch laufenden Immunisierungsstudie werden die beiden MUC-1-Epitope in eine Vakzine integriert, bei der insgesamt 13 HLA-A*02-restringierte Epitope, die neben MUC-1 auch von Her-2/neu, NY-ESO-1, MAGE-1, CEA und SSX-2 abstammen, auf autologe reife dendritische Zellen (DC) geladen werden. Vakziniert werden Patientinnen mit Knochenmetastasen, die parallel eine anti-endokrine und/oder Bisphosphonat-Therapie erhalten. Bisher konnte nur in 1/7 analysierten Patientinnen eine Frequenzzunahme MUC-1- spezifischer T-Zellen nach Vakzinierung gezeigt werden - diese Studien dauern jedoch noch an und wurden nicht über diesen Antrag gefördert. Mit der fortschreitenden Entwicklung hochsensitiver Nachweismethoden zur Detektion niederfrequenter spezifischer T-Zellen können T-Zellantworten gegen tumorassoziierte Antigene in Krebspatienten analysiert werden. Dies ermöglicht Rückschlüsse auf den „Immunstatus" von Patientinnen, der sowohl vom Tumor als auch von therapeutischen Interventionen beeinflusst wird. So können künftig besser Patientenkollektive definiert werden, die von Immunsierungsstrategien profitieren. Der Erfolg einer Vakzinierung könnte dann auch anhand der Charakterisierung vakzineinduizierter T-Zellen als „biologischer Endpunkt" einer Studie und potentieller Surrogatparameter für das klinische Ansprechen gemessen werden. Der Einsatz peptidbasierter Vakzinen zur Tumortherapie kann durch Epitopmodifikationen, die zur Verbesserung ihrer HLA-Bindungseigenschaften führen, optimiert werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Evaluation of pre-existent immunity in patients with primary breast cancer: molecular and cellular assays to quantify antigen-specific T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells. Clin Cancer Res. 9(12):4376-4386, 2003
Rentzsch C, Kayser S, Stumm S, Watermann l, Walter S, Stevanovic S, Wallwiener D, and Gückel B
- (2004) Dissertation; Fakultät für Biologie der Eberhard-Karls Universität Tübingen. „Vergleichende Validierung und Charakterisierung tumorspezifischer T-Zellen in Mammakarzinompatientinnen und Gesunden"
Christine Rentzsch
- A CD80- transfected human breast cancer cell variant induces Her-2/neu-specific T-cells in HLA-A*02-matched situations in vitro as well as in vivo. Cancer Immunol Immunother 54:129-40, 2005
Gückel B, Stumm S, Rentzsch C, Marmé A, Mannhardt G, Wallwiener D
- Development, monitoring and first results of a phase l/ll vaccination trial using genetically modified allogeneic breast cancer cells. 3rd Intemational Symposium on the Clinical Use of Cellular Products, Regensburg 2005, #D6
Gückel B, Stumm S, Rentzsch C, Kayser S, Gruber l, Marmé A, Huober J, Meuer S, Wallwiener D
- Immundiagnostische Verfahren im Rahmen zweier zellulärer Vakzinierungsstudien bei Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom. XIX. Akad. Tagung deutschsprechender Hochschullehrer in der Gyn u GebH, Basel 14./15.10.2005, Geburtshilfe u. Frauenheilkunde 2005; 66:S1-S48, S43
Gückel B, Kayser S, Rentzsch C, Marmé A, Gruber I, Wallwiener D
- Pre-existing T-cell immunity against mucin-1 in breast cancer patients and healthy volunteers. J Cancer Res Clin Oncol. 132(4):265-274, 2006
Gückel B, Rentzsch C, Nastke M-D, Marmé A, Gruber l, Stevanovic S, Kayser S, Wallwiener D
- Characterization of MUC-1 specific T-cells in breast cancer parients and healthy donors. 5th annual CIMTmeeting, april 2007, Würzburg, P40
Bagû AC, Kayser S, Stevanovic S, Marmé A, Gruber I, Wallwiener D, Attig S, Gückel B
- Charakterisierung MUC-1-spezifischer T-Zellen in Brustkrebspatientinnen und gesunden Kontrollen. Senologie 2007, 4:107
Bagû AC, Kayser S, Stevanovic S, Marmé A, Gruber l, Wallwiener D, Gückel B
- Vakzinierungen mit peptidbeladenen dendritischen Zellen führen zur Aktivierung Tumorantigen-spezifischer Immunreaktionen in Brustkrebspatientinnen. DGGG 2008, Hamburg, GebFra S107, 2008
Gückel B, Kayser S, Gruber I, Waidmann M, Wallwiener D, Marmé A
- Vakzinierungsstrategien beim Mamma- und Ovarialkarzinom. MedReport zum 28. Deutschen Krebskongress Feb. 2008 in Berlin. Blackwell Verlag
Gückel B.
- Vakzinierungsstrategien beim metastasierten Mammakarzinom: Erfahrungsbericht aus zwei laufenden Phase-I/ll-Studien. MedReport (Blackwell Verlag), 32.Jahrgang, N° 40, Berlin 2008 (zur 28. Jahrestagung der Dt. Gesellschaft für Senologie in Stuttgart)
Gückel B.
