Molekulare Analyse von Eisen- und Zink-Aufnahme Systemen in Escherichia coli mit Schwerpunkt ZupT
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Eine große Zahl von ZIP-Transportern (TC 2.A.5) von Eukaryoten inklusive der des Menschen sind Gegenstand recht intensiver Forschung. ZIP Permeasen spielen in diesen Organismen eine herausragende Rolle für die Homöostase der Metall-Co-Faktoren Zink und Eisen, Demgegenüber ist ZupT aus Escherichia coli der einzige untersuchte prokaryotische Vertreter dieser Proteinfamilie. Es konnte gezeigt werden, dass ZupT ein Transporter mit breitem Substratspektrum ist und neben Zn(ll) auch Fe(ll), Co(ll), Mn(ll) Cd(ll) in die Zelle transportiert. Für diese Untersuchungen wurden spezielle E. coli Deletionsstämme konstruiert, denen alle bekannten Transporter eines Metalls fehlten. In diesen Stämmen können die individuellen Transportleistungen einzelner Transporter untersucht werden. Damit sind diese Stämme wichtige Werkzeuge für physiologische Untersuchungen nicht nur in den Arbeitsgruppen Grass und Nies, sondern auch fuer internationale Kollegen, die diese Mutanten häufig anfragen. Untersuchungen zur Frage der Energetisierung des ZupT venmittelten Transports ergab Unterschiede zu den eukaryotischen ZiPs. Metalltransport durch ZupT wird nicht durch Bicarbonat stimuliert, sondern die Transportaktivität wird durch Protonenmotorische Kraft beeinflusst. Kompetitionsexperimente mit verschiedenen Metallkationen ergaben, dass Zn(ll) und Cadmium wahrscheinlich das bevorzugte Substrat von ZupT ist. Gerichtete Mutagenese zum gezielten Austausch verschiedener Aminosäuren innerhalb des ZupT- Proteins legten einige Positionen offen, die wichtig für die Funktion von ZupT waren. Dabei gab es Austausche, die zur weitgehenden Inaktivierung der Transportaktivität von ZupT führten. Das waren hauptsächlich geladene Aminosäurereste innerhalb transmembraner Regionen. Andere Austausche verringerten nur die Transportaktivitäten für eines (oder einige) der Substrat-Metallkationen, während andere weiterhin transportiert wurden. Dadurch konnten Positionen aufgedeckt werden, die zur Substratspezifität innerhalb von ZupT beitragen. Eisen-Aufnahme mit Hilfe des Catecholat-Siderophors Enterobaktin ist eine der zentralen Mechanismen zur Eisenversorgung von E. coli. Während viele frühere Untersuchungen die Aufnahme von mit Fe(lll)-beladenem Ferric-Enterobaktin zum Gegenstand hatten, war nichts über den Transport von Apo-Enterobaktin aus dem Periplasma in das Außenmedium bekannt. Mittels HPLC-Analyse von sezerniertem Enterobaktin in Mutantenstämmen konnte gezeigt werden, dass TolC, ein Tunnelprotein der Äußeren Membran, zusammen mit noch unbekannten Protein-Komponenten an diesem Transportprozess beteiligt ist. Unenwarteterweise kann das Wachstum der E. coli Mutante, der alle Eisenaufnahmesysteme fehlen, durch Zugabe von Mangan deutlich verbessert werden. Während die molekularen Mechanismen für diesen Effekt weiterhin im Dunkeln liegen, konnte im Verlauf der zweiten Antragsphase das Zusammenspiel von Eisen, Mangan und anderen Metallen für diese Mutante weiter charakterisiert werden. Diese Untersuchungen schlössen Transkriptom-Analysen ein. Transkriptom Analyse der Genexpression eines E. coli Stammes, dem alle Eisenaufnahme- Systeme fehlen deckten auf, dass weitere mögliche Eisen-Transporter in E. coli existieren könnten. Unter diesen ist die Pemnease EfeU (YcdN), die zusammen mit EfeB (YcdB) und EfeO (YcdO) das erste charakterisierte bakterielle FTR-System darstellt. FTR-Permeasen sind die wichtigsten Eisenaufnahmetransporter in Pilzen und Algen. Wir konnten zeigen, dass EfeU in Laborstaemmen von E. coli Inaktiv ist, aber in (pathogenen) Wildstämmen als Eisenaufnahmesystem funktioniert. Ein weiterer, neuer FTR-artiger Eisenaufnahmetransporter aus uropathogenen E. coli Stämmen, FetPM, ist gegenwärtig Gegenstand eingehender Untersuchungen in unseren Laboratorien. Ebenso gelang es, mit den Deletionstämmen zu zeigen, dass das Aufnahmesystem für anorganisches Phosphat, PitA, wahrscheinlich auch in der Lage ist, durch Eisen-Phosphat-Transport, zur zellulären Eisenversorgung beizutragen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- 2005. The metal permease ZupT from Escherichia coli is a transporter with a broad substrate spectrum. J Bacteriol 187:1604-1611
Grass, G., S. Franke, N. Taudte, D. H. Nies, L. M. Kucharski, M. E. Maguire, and C. Rensing
- 2005. TolC is involved in enterobactin efflux across the outer membrane of E.coli. J Bacteriol 187
Bleuel, C, C. Große, N. Taudte, J. Scherer, D. Wesenberg, G. J. Krauß, D. H. Nies, and G. Grass
- 2006. A new ferrous ironuptake transporter, EfeU (YcdN), from Escherichia coli. Mol Microbiol 62:120-131
Grosse, C, J. Scherer, D. Koch, M. Otto, N. Taudte & G. Grass
- 2006. Biometall-Homöostase in Escherichia coli. Habilitationsschrift. Martin- Luther-Universität, Halle-Wittenberg
Grass, G.
- 2006. Iron transport in Escherichia coli: All has not been said and done. Biometals 19:159-172
Grass, G
- 2007. New transport deals for old iron. In: Molecular Microbiology of Heavy Metals, pp. 221-233
Grass, G.
