Structure-function analysis of the Escherichia coli periplasmic chaperone SurA
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das periplasmatische Chaperon SurA ist maßgeblich an der korrekten Reifung integraler β-Faß-Proteine der äußeren Membran (OMPs) von Escherichia coli beteiligt. SurA ist aus einer N-terminalen Region, einer inaktiven und einer aktiven Parvulin-ähnlichen Peptidyl-Prolyl- Isomerase (PPIase)-Domäne (Domänen I und II) sowie einer kurzen C-terminalen Helix aufgebaut. Die N- und C-terminalen Regionen vermitteln die Chaperonaktivität und sind zur Ausübung der in vivo-Funktion von SurA ausreichend. In vitro interagiert SurA bevorzugt mit neu-synthetisierten OMPs und bindet selektiv kurze OMP-Peptide mit speziellen Mustern aromatischer Aminosäuren, deren Seitenketten in einer für OMPs charakteristischen Weise ausgerichtet sind. Wie SurA auf molekularer Ebene mit seinen Substraten interagiert und wie es gebundene Substrate wieder freisetzt, ist bisher ungeklärt. Im Cytoplasma treiben viele Chaperone ihre Substratbindungs- und -freisetzungszyklen mit Hilfe von ATP an. Im Periplasma stehen ATP oder vergleichbare bekannte Energiequellen jedoch nicht zur Verfügung. Zur weiteren Klärung der molekularen Wirkprinzipien sollten die zur Bindung von OMP-Peptiden relevanten Bereiche in SurA mittels elektronenparamagnetischer Resonanz-(EPR-) Spektroskopie identifiziert werden. Das EPR-Spektrum einer mit der Radikalsonde MTSSL markierten Cystein-Seitenkette gibt Aufschluss über ihre Mobilität in der Proteinumgebung. Veränderungen ihrer Mobilität, z.B. durch Bindung eines Substrates in unmittelbarer Nähe, gehen mit einer charakteristischen Änderung des EPR-Spektrums einher. Zur Identifizierung einer Peptid- Bindestelle in SurA erwies sich dieses Verfahren jedoch als nur bedingt geeignet. Zahlreiche Positionen, die gemäß der für SurA verfügbaren Strukturdaten ausreichend exponiert sein sollten, waren für eine Markierung mit der Sonde nicht zugänglich oder die eingeführte Sonde zeigte eine wider Erwarten geringe, unzureichende Grundmobilität. Damit war die Zahl geeigneter, oberflächenexponierter Positionen in SurA stark eingeschränkt. Mitte 2007 wurden von Xu et al. kristallographische Strukturen von SurA-Subdomänen im Komplex mit artifiziellen Peptiden publiziert, die eine Peptid-Bindestelle in der inaktiven PPIase-Domäne I von SurA offenbarten. Unsere darauf hin mit der isolierten Domäne I von SurA und bekannten, SurA-bindenden OMP-Peptiden durchgeführten EPR- und Fluoreszenz-spektroskopischen Analysen zeigen jedoch, dass nur einzelne der getesteten Peptide schwach mit diesem Bereich von SurA interagieren. Dieser Befund deutet auf die Existenz möglicher weiterer spezifischer und/oder unspezifischer Substrat-Bindestellen in SurA hin. Die kristallographischen Strukturen der SurA:Peptid-Komplexe wiesen ferner auf eine durch Substratbindung induzierte Dimerisierung von SurA hin. Mit Hilfe eines in unserer Arbeitsgruppe etablierten prokaryotischen two-hybrid-Systems hatten wir bereits eine Di- bzw. Oligomerisierung von SurA in vivo beobachtet. Unsere hier anknüpfenden Struktur-Funktionsanalysen deuten darauf hin, dass die in den Strukturen beobachteten SurA:Peptidund SurA:SurA-Kontakte auch bei der Substratbindung und der Di- bzw. Oligomerisierung von SurA in vivo eine Rolle spielen, für seine in vivo-Funktion jedoch nicht notwendig sind. Insgesamt sprechen unsere Befunde für die Existenz weiterer SurA:Substrat- und möglicherweise auch weiterer SurA:SurA-Kontaktbereiche mit Relevanz für die Chaperonfunktion von SurA. Ihre Detektion erfordert weiterführende, umfassende Analysen der Interaktion von SurA mit seinen natürlichen Substraten. Erste Vorarbeiten zur Etablierung eines hierfür geeigneten Verfahrens wurden im Rahmen des Projektes bereits geleistet.
