Funktionelle Charakterisierung der Popeye Genfamilie
Final Report Abstract
2.1. Allgemeinverständliche Darstellung der wesentlichen Ergebnisse und der erzielten Fortschritte gegenüber dem Stand des Wissens zum Zeitpunkt der Antragstellung. Die Popeye Genfamilie wurde von meiner Arbeitsgruppe aufgrund einer starken Expression in der Herzmuskulatur identifiziert. Die Gene kodieren für Membranproteine mit drei Transmembrandomänen, die insbesondere in Muskelzellen vorkommen. Hinsichtlich der Funktion dieser Proteine haben wir im Rahmen der Projektförderung große Fortschritte erzielen können. Am Beginn des Projekts war bekannt, dass es sich um eine neuartige Klasse von Proteinen handelt, die in der Herz- und Skelettmuskulatur besonders stark exprimiert werden. Aufgrund fehlender Sequenzhomologie, war es nicht möglich, eine Funktion für diese Proteine vorherzusagen. Zyklisches Adenosin Monophosphat (cAMP) ist ein universelles Botenmolekül, das in Zellen an der Informationsübertragung beteiligt ist. Mit Hilfe bioinformatischer Verfahren zur Vorhersage der 2- und 3- dimensionalen Struktur konnte eine signifikante strukturelle Homologie zu cAMP-bindenden Proteinen für die evolutionär stark konservierte Popeye Domäne demonstriert werden. Auch der direkte biochemische Nachweis einer Bindung zyklischer Nukleotide war erfolgreich. Wir konnten zeigen, dass alle drei Popdc Proteine in der Lage sind cAMP zu binden. Popdc Proteine sind integrale Bestandteile der Plasmamembran von kardialen Myozyten. Wir haben untersucht, ob Popdc Proteine porenbildende Eigenschaft besitzen und als Ionenkanäle fungieren. Popdc Proteine waren aber nicht in der Lage die Leitfähigkeitseigenschaften von Xenopus Oozyten zu verändern. Allerdings können Popdc Proteine die Leitfähigkeit einer bestimmten Klasse von Ionenkanälen, den sogenannten Tandemporenkanäle verändern. Die Leitfähigkeit von dem Tandemporenkanal TREK-1 wird durch Ko-expression der Popdc Proteine verdoppelt. Wir haben dann gefragt, ob diese Interaktion durch cAMP moduliert werden kann. Zur Beantwortung dieser Frage wurde ein bi-molekularer FRET- Sensor konstruiert und in Zellen transfiziert. Mit Hilfe dieses experimentelles Ansatzen konnten wir demonstrieren, dass cAMP die Interaktion von Popdc Proteinen mit TREK1 modulieren kann. Aus den FRET Daten und mit Hilfe einer Radioligandenbindungsstudie konnte ein numerischer Wert für die Affinität der cAMP-Bindung bestimmt werden. Popdc Proteine besitzen demnach eine Affinität für cAMP, die mit der von anderen cAMP-Mediatoren wie z.B. Protein Kinase A, EPAC und HCN Kanälen vergleichbar ist. Neben den großen Fortschritten auf dem Gebiet ! $"! der Proteinbiochemie, konnten wir auch in Hinblick auf die genetische Funktionsanalyse der Popdc Proteine signifkante Fortschritte erzielen. Wir haben zwei Nullmutanten für Popdc1 und Popdc2 in der Maus erzeugt. Beide Mausmutanten sind lebensfähig und dies gilt auch für die Doppelnullmutante. Ausgehend von der Beobachtung, dass Popdc1 und Popdc2, eine starke Expression im Reizleitungssystem aufweisen, haben wir EKG Analysen in den Mäusen durchgeführt. Diese Untersuchungen zeigten, dass beide Nullmutanten eine stressinduzierte Sinusknotenbradykardie haben. Die Herzfrequenz in diesen Tieren kann sich nicht an den physiologischen Bedarf anpassen. Anstatt einer Herzratenbeschleunigung, setzt der Herzschlag unter physischer oder psychischer Belastung für eine kurze Zeit aus. Diese sogenannten Synkopen würden bei Menschen mit solch einer Erkrankung Schwindel oder gar Bewusstlosigkeit auslösen. Histologische Analysen in den Nullmutanten zeigen, dass Zellen des Sinusknotens reduziert sind und strukturelle Veränderungen aufweisen. Interessanterweise tritt dieser Phänotyp nur in Mäusen auf, die älter als 8 Monate sind. In 16 Monate alten Popdc2 Nullmutanten wurden auch ventrikuläre Arhythmien beobachtet, bis hin zum Auftreten von ventrikulären Fibrillationen. Auch diese ventrikulären Arrhythmien traten ausschließlich stressinduziert auf. Da Stress intrazellulär durch den Botenstoff cAMP vermittelt wird, gilt es nun die Zusammenhänge zwischen den Phänotypen in den Mäusen und der Biochemie der Proteine herauszuarbeiten. Insbesondere von klinischer Relevanz erscheint es, die Rolle des Alterns als Determinante des Phänotyps genauer verstehen zu lernen. Insbesondere auf dem Hintergrund, dass kardiale Arrhythmien in ihrem quantitativen Auftreten stark mit dem Alter der Patienten korreliert sind, sind diese Mausmodelle möglicherweise neuartige Modelle für altersbedingte Reizleitungsstörungen. Studien wurden auch im Zebrafischmodell durchgeführt. Ein Verlust der Popdc Gene im Zebrafisch führt ebenfalls zum Auftreten von Arrhythmien. Allerdings tritt im Unterschied zur Maus, der Phänotyp bereits in 4-5 Tage alten Zebrafischlarven auf. Die Arrhythmien treten spontan auf und sind nicht stressinduziert. Der Verlust von Popdc2 und Popdc3 resultiert in AV-Überleitungsstörungen, während für Popdc1 Sinusarrhythmien beobachtet wurden. Dieser Befund einer evolutionär konservierten Rolle in der Erregungsbildung im Herzen ist sehr interessant und macht es sehr wahrscheinlich, dass diese Proteinfamilie auch für das menschliche Herz sehr wahrscheinlich von Bedeutung ist.
Publications
- (2006). Comparative analysis of mRNA and protein expression of Popdc1 (Bves) during early development in the chick embryo. Dev Dyn 235:691-700
Torlopp A, Breher SS, Schlüter J, Brand T
(See online at https://doi.org/10.1002/dvdy.20687) - (2007) The Popeye domain containing gene 2 (Popdc2). Generation and functional characerization of a null mutant in mice and propmoter analysis. Dissertation an der Biologischen Fakultät der Universität Würzburg
Alexander Froese
- (2007). The Popdc gene family in the rat: molecular cloning, characterization and expression analysis in the heart and cultured cardiomyocytes. Biochim Biophys Acta 1769:586-592
Parnes D, Jacoby V, Sharabi A, Schlesinger H, Brand T, Kessler-Icekson G
(See online at https://doi.org/10.1016/j.bbaexp.2007.06.001) - (2008) Die kardiale Funktion von Popdc1 in der Maus: vom Gen zum Phän. Dissertation an der Biologischen Fakultät der Universität Würzburg
Stephanie Breher
- (2008) Expression pattern of Popdc2 during mouse embryogenesis and in the adult. Dev Dyn 237:780-787
Froese A, Brand T
(See online at https://doi.org/10.1002/dvdy.21431) - The Popeye Domain Containing 2 (Popdc2) Gene is Essential for Sinus Node Function. 81st Annual Scientific Session of the American-Heart- Association, 8 Nov 2008 - 12 Nov 2008. Circulation 118:S323-S3234.3
Brand T; Froese A; Breher SS; Schlueter J; Waldeyer C; Kirchmaier B; Kuhtz J; Torlopp A; et al.
