Untersuchungen des kooperativen Mechanismus der RhoA-ROCK Interaktion
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel dieses Forschungsvorhabens war die detaillierte biochemische und strukturelle Charakterisierung der intramolekularen Regulation von Effektoren sowie deren Aktivierung durch kleine GTP-bindende Proteine (oder GTPasen). Die Optimierung effizienter Verfahren zur Expression und Reinigung von Proteinen und Proteinfragmenten in großem Maßstab sowie die Entwicklung einer zuverlässigen 4 Messmethode zur zeitaufgelösten Messung von GTPase-Effektor-Interaktion waren dabei Voraussetzung, um diese Herausforderungen zu meistern. Protokolle zur Expression, Isolierung und Reinigung von aggregierenden Rho- Isoformen RhoB und RhoC wurden erarbeitet. Grundlegende Eigenschaften dieser Proteine wurden biochemisch und biophysikalisch in direktem Vergleich mit RhoA untersucht und charakterisiert. In Gegensatz dazu war es nicht realisierbar, große Fragmente des humanen ROCK-Proteins (z. B. ROCKfcc) in präparativen Maßstab und adäquater Qualität unter Verwendung verschiedener Expressionsysteme (Escherichia coli, Baculovirus und Pichia pastoris) und verschiedener Bedingungen herzustellen. Nicht nur die Qualität, Reinheit und Ausbeute sondern (und interessanterweise) die Leistungsfähigkeit der entsprechenden Proteinfragmente verfehlten alle Erwartungen. Partiell gereinigtes ROCK-Fragment ROCKfcc beispielsweise, das in einem Baculovirus- Insektenzell-System exprimiert war, wies keine Bindungsfähigkeit für die Rho-Isoformen unabhängig von ihren nukleotid-gebundenen Formen auf. Wir untersuchen zurzeit die Qualität und Ausbeute von ROCK-Proteinen in einem neuen Expressionssystem (Dictyostelium discoideum). Verschiedene Fluoreszenz-Derivate (tamra, alexa und Cy5) von GppNHp (ein nicht hydrolysierbares GTP Analogon) sowie CFP- und YFP-Fusionsproteine zur FRETMessung wurden hergestellt, um die Rho-Interaktionen mit den ROCK-Domänen direkt messen zu können. Bei diesen Arbeiten haben wir das fluoreszenzmarkierte Nukleotid tamraGTP identifiziert, das die besondere Eigenschaft besitzt, als Sensor des nukleotidgebundenen Zustands zu dienen. In der GTP-gebundenen Konformation ist das Fluoreszenzsignal höher als im GDP-gebundenen Zustand. Hierdurch ist es möglich, sowohl die intrinsische, als auch die GAP stimulierte GTP-Hydrolysereaktion in Echtzeit qualitativ und quantitativ zu analysieren. Trotz dieser sehr interessanten Entdeckung ist uns bis heute der große Durchbruch zur zeitaufgelösten Aufnahme der Rho-ROCK-Interaktion verwehrt geblieben. Direkte Proteinmarkierung mittels Fluoreszenzreportergruppen gehören zu den neuen Entwicklungen dieses Projekts, die zurzeit in Arbeit sind. Über diese Arbeiten hinaus haben wir außerdem (i) das neue Rho-ähnliche Protein TC10 biochemisch charakterisiert, (ii) die Struktur-Funktion der RhoGEFs LARG, PRG, p115 and p190 eingehend analysiert und (iii) mit synGAP eine neuartige Form der GAPFunktion identifiziert. Im Rahmen dieser Förderung haben wir schließlich neue Erkenntnisse gewonnen, die unser Verständnis über die Regulation von GTPasen, und ihrer Netzwerke in der Signaltransduktion erweitern.
