Proteintrennung in Mikrofluidiksystemen mit Laser-induzierter nativer UV-Fluoreszenzdetektion
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen dieses von der DFG geförderten Forschungsvorhabens ist ein Konzept zur Einzelzellanalytik in Mikrofluidik-Systemen vorgestellt worden. Die Methode kombiniert die einzelnen Schritte von der Auswahl und Navigation der Zelle über die Lyse bishin zur Proteinauftrennung und -detektion auf einem einzelnen Mikrofluidik-Chip. Dafür wurde zunächst eine geeignete Oberflächenfunktionalisierung zur Vermeidung von Zelladhäsion und unspezifischer Proteinadsorption an die PDMS Kanalwände entwickelt. Es stellte sich heraus, dass sowohl die Silanisierung als auch die Adsorption mit POE zur Beschichtung der PDMS/Glas Mikrofluidik-Kanäle geeignet ist. Insbesondere die F108-Beschichtung auf Sauerstoffplasma oxidierten Oberflächen hat sich durch eine gute Langzeitstabilität bewährt. Für die Proteinanalytik wurde ein höchst empfindlicher konfokaler Aufbau zur LIF-Detektion im sichtbaren sowie im UV-Bereich realisiert. Es konnte gezeigt werden, dass damit Aminosäurekonzentrationen im nM-Bereich detektierbar sind. Durch die Verwendung von schwarzen Kohlenstoffpigmenten konnte das (S/N)-Verhältnis um das 4fache gesteigert werden, was einer theoretischen Detektionsgrenze von 25nM entspricht. Dieses stellt die bisher niedrigste elektrokinetisch injizierte und mittels UV-LIF delektierte Aminosäurekonzentration in Mikrofluidik-Kanälen dar. Des Weiteren ist die Auftrennung von Proteinen in kürzester Zeit (150 s) in F108 beschichteten PDMS/Quarz Mikrofluidik-Kanälen gelungen. Das Konzept der Einzelzellanalytik ist zunächst an genetisch transfizierten Zellen im sichtbaren Bereich durchgeführt worden. Dabei wurden die transfizierten Zellen mittels einer optischen Pinzette ausgewählt und zum Punkt der Lyse transportiert. Für die Lyse der Zelle konnten sowohl die elektrische Lyse mit definierten Hochspannungspulsen als auch die chemische Lyse mit dem Detergenz SDS in mikrofluidisehen Systemen erfolgreich eingesetzt werden. Zur Überprüfung des vorgestellten Konzepts wurden einfach (T31N-GFP) und anschliessend zweifach transfizierte Zellen (y-PKC-GFP und PEP12-YFP) analysiert. Die Elektropherogramme demonstrieren den erfolgreichen Nachweis der GFP- und YFP-Konstrukte nach der Lyse der jeweiligen Zelle. Aufbauend auf diesen erfolgreichen Ergebnissen ist es erstmalig gelungen, Elektropherogramme einzelner Zellen mit nativer Fluoreszenz aufzunehmen. Im Vergleich des Einzelzellelektropherogramms mit einem vier Zellen-Elektropherogramm konnten gesteigerte Peakintensitäten durch den höheren Proteinanteil festgestellt sowie einzelne Peakgruppen zugeordnet werden. Für zukünftige Einzelzellanalysen ist eine weitere Steigerung der Trenneffzienz. erzielbar, indem die bisherige Beschichtung zur Vermeidung unspezifischer Proteinadsorption durch dynamische oder quervernetzende Polymer Beschichtungen ergänzt wird. Ferner bietet die Verwendung eines vollständig aus Quarz hergestellten Mikrofluidik- Chips neben einer verringerten Hintergrundfluoreszenz den Vorteil, eine bessere Kontrollierbarkeit des elektroosmotisehen Flusses aufgrund definierterer Oberflächeneigenschaften zu ermöglichen. Neue parallelisierte Kanalgeometrien bieten in Kombination mit anderen Injektionsmethoden (z.B. die gated Injektion) die Möglichkeit der gleichzeitigen und schnellen Analyse von einzelnen Zellen. Dadurch wird ein direkter Vergleich der Analysen unter identischen Bedingungen bei gleichzeitiger Erhöhung des Durchsatzes möglich. Mit Hilfe der Dielektrophorese lassen sich einzelne Zellen in einem elektrisch inhomogenen Wechselfeld energetisch fangen und berührungslos transportieren. Diese Methode ist gegenüber der optischen Pinzette vollständig auf dem Mikrofluidik-Chip integrierbar und automatisierbar, so dass sich eine einfachere Handhabung des Lab-On-A-Chip ergibt. Als zukünftiges Ziel wird die Realisierung einer markierungsfreien Detektion eines Protein- Fingerabdruckes in Mikrofluidik-Systemen verfolgt. Mit dieser Methode wird die Möglichkeit bestehen, Zellen in verschiedenen Stadien und unter bestimmten Bedingungen (z.B. Stresseinwirkung) zu untersuchen. Durch den Vergleich der Protein-Profile können Erkenntnisse über zelluläre Zusammenhänge gewonnen werden und so Beiträge zur System Nanobiologie geliefert werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Poly(ethyleneoxide) Based Surface Coatings for Poly(dimethylsiloxane) Microchannels; Langmuir 21, 7551-7557, 2005.
W. Hellmich, J, Regtmeier, T.T. Duong, R. Ros, D. Anselmetti, A. Ros,
- Single Cell Analytics for NanoBiology; Nanobiotechnology, 1(3), 267-270 (2005).
D. Anselmetti, N. Griemla, W. Hellmich, K. Leffhalm, A. Ros, R. Ros, and K, Tönsing,
- Single Cell Manipulation, Analytics and Label-free Protein Detection in Microfluidic Devices for Systems NanoBiology; Electrophoresis 26,3689-3696,2005.
W. Hellmich, Ch. Pelargus, K. Leffhalm, A. Ros, and D. Anselmetti,
- Towards Single Cell Fingerprinting in Microfluidic Device Format: Single Cell Manipulation, Protein Separation and Detection; Micro Total Analysis Systems Vol. 1,406-408, 2005, Proceedings of the jtTAS 2005, Boston, (ISBN: 0-9743611-1-9).
W. Hellmich, K. Leffhalm, A. Sischka, T. Duong, N. Jensen, K. Niehaus, K. Tönsing, A. Ros, and D. Anselmetti,
- Bioanalysis in Structured Microfluidic Systems; Electrophoresis 27,2651-2658,2006.
A. Ros, W, Hellmich, J. Regtmeier, T. T. Duong and D, Anselmetti
- Einzelzellanalyik in Mikrofluidik-Systemen, Dissertation, Universität Bielefeld, 2006
Wibke Hellmich
- Improved native UV laser induced fluorescence detection for single cell analysis in poly(dimethylsiloxane) microfluidic devices; Journal of Chromatography A 1130, 195-200, 2006.
W. Hellmich, D, Greiff, Ch, Pelargus, D. Anselmetti, and A. Ros,
- Single Cell Manipulation, Analytics and Label-free Protein Detection in Microfluidic Devices for Systems NanoBiology; in "Microfluidic Applications in Biology: From Technologies to Systems Biology", (Chapter 11), Edited by Niels Lion, J.S. Roussier, H. Girault, WILEY-VCH, Weinheim, ISBN 978-3- 527-31761-5,2006
W. Hellmich, Ch, Pelargus, K. Leffhalm, A. Ros and D. Anselmetti
- Migrationsphänomene und Einzelzellanalytik in Mikrofluidiksystemen, Habilitation, Universität Bielefeld (2007)
Alexandra Ros
- Single Cell Analysis by Native UV Laser Induced Fluorescence Detection in a PDMS Microfluidic Chip; Proceedings of the ftTAS 2007, Paris, in press, 2007
D. Greif, D, Anselmetti, R. Ros,
