Markierungsfreies Proteinanalysesystem

• Fachliche Zuordnung: Medizin
• Förderung: Förderung in 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 532011498

Ein mechanistisches Verständnis zellulärer Prozesse hängt stark von in-vitro-Rekonstitutionsansätzen ab, gestützt durch biochemische und biophysikalische Methoden. Die Isolation einzelner Reaktionen oder sogar ganzer Signalwege aus dem zellulären Kontext ermöglicht ihre Charakterisierung auf molekularer Ebene ohne störende Einflüsse aus der zellulären Umgebung. In diesem Zusammenhang lieferten die Rekonstitutionsansätze, durchgeführt von Arbeitsgruppen, die an diesem Antrag beteiligt sind, wichtige Einblicke in ein breites Spektrum molekularer Prozesse; beispielsweise Proteinhomöostase und Zellzyklus-Checkpoints. Diese Prozesse werden von Proteinnetzwerken ausgeführt, bei denen die koordinierte, aufeinander folgende Interaktion von Proteinen und Kofaktoren die Regulierung von zellulärem Stress und des Zellzyklus ermöglicht. Die Bestimmung von Parametern, die biomolekulare Wechselwirkungen in diesen Proteinnetzwerken definieren, wie Affinitätskonstanten und Interaktionskinetiken, ist essenziell für das Verständnis wesentlicher zellulärer Prozesse. Die Bio-Layer-Interferometrie (BLI) ist für die Untersuchung von Wechselwirkungen in biologischen Systemen optimiert. BLI ermöglicht die Echtzeit-Analyse von biomolekularen Wechselwirkungen und die genaue Quantifizierung von Proteinen in komplexen Proben. Die Moleküle müssen dazu nicht markiert werden. BLI beruht auf der Messung der Veränderungen der optischen Schichtdicke, die sich von einer Biosensor-Referenzoberfläche bis zu den an diese Oberfläche gebundenen Biomolekülen erstreckt. Konkret wird eine Veränderung des Interferenzmusters von weißem Licht, das von den beiden Oberflächen reflektiert wird, festgestellt. Bei einem typischen Experiment wird ein Ligand auf die Oberfläche eines Biosensors immobilisiert. Der beladene Biosensor wird dann in eine Lösung getaucht, die den Analyten enthält, d. h. die Nachweisoberfläche wird direkt mit dem Analyten in Kontakt gebracht, ohne dass eine Mikrofluidik erforderlich ist. Der Analyt bindet an den immobilisierten Liganden und bewirkt eine Veränderung der Schichtdicke. Diese Änderung wird als Wellenlängenverschiebung gegenüber der Referenzoberfläche erkannt und ist ein direktes Maß für die Bindung. Ungebundene Moleküle in der Analytlösung stören die Messung nicht. Dementsprechend können sogar Lysate als Analytenlösung verwendet werden. Mithilfe von BLI können wir Interaktionsparameter innerhalb von Proteinnetzwerken vergleichen, potenzielle kooperative Bindungsmodi bewerten und die Halbwertszeiten von biomolekularen Komplexen bestimmen. Über die Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen hinaus planen wir die Entwicklung funktioneller Assays, wie z. B. In-vitro-Ubiquitinierungsassays, die auf BLI als Indikator beruhen. Schließlich werden BLI-Messungen bei der Entwicklung und Untersuchung der Wirkung von kleinen Molekülmodulatoren für Reaktionen im Zusammenhang mit der Proteinhomöostase und Zellzyklus-Checkpoints helfen.

• DFG-Verfahren: Forschungsgroßgeräte
• Großgeräte: Markierungsfreies Proteinanalysesystem
• Gerätegruppe: 3160 Biomolekular-Interaktionssysteme
• Antragstellende Institution: Universität Duisburg-Essen
• Leiterin: Professorin Doris Hellerschmied, Ph.D.