Mikrokompartimentierung der Molybdäncofaktor-Biosynthese und Verteilung des gebildeten Cofaktors
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Labor des Hauptantragstellers wurde der Molybdäncofaktor(Moco)-Biosyntheseweg bei Arabidopsis in den Grundzügen aufgeklärt, und es wurden drei der fünf pflanzlichen Mo-Enzyme erstmals kloniert und biochemisch charakterisiert. Ziel des vorliegenden Projektes war es, die Mikrokompartimentierung der Moco-Biosynthese und Verteilung des gebildeten Cofaktors aufzuklären. Dazu wurden drei Ziele verfolgt: 1. Subzelluläre Lokalisierung des Moco-Biosyntheseweges und seiner Nutzerenzyme: Bis auf die Sulfitoxidase (peroxisomal) sind alle anderen Nutzerenzyme cytoplamatisch lokalisiert. Das wurde auch für die Proteine der Moco-Biosyntheseschritte 2 und 3 gefunden. Überraschend war jedoch der Befund, dass der erste Schritt der Moco- Biosynthese in den Mitochondrien lokalisiert ist. 2. Der Moco-Biosynthesekomplex: In vorangegangenen Projekten hatten wir die Bildung eines Moco-Biosynthesekomplexes postuliert, der eine effiziente Weitergabe der instabilen Intermediate garantiert ("substrate-product-channeling"). Zum in vivo-Nachweis dieses Komplexes haben wir neuen Vektoren für BiFC (bimolekulare Fluoreszenz Complementation) entwickelt, die verbesserte Fluoreszenzproteine enthalten und nun im GATEWAY-System vorliegen. Zum anderen haben wir ein in vitro- Verfahren weiterentwickelt, das cross-linking mit Label-Transfer verbindet. Unter Nutzung beider Verfahren konnte die Existenz des Moco-Biosynthese Komplexes in vivo nachgewiesen werden. Wir haben mittels in vivo- und in vitro-Methoden in der Zelle ein Interaktions-Netzwerk aufgedeckt zwischen Proteinen, die an der Moco-Biosynthese und seiner Verteilung beteiligt sind. 3. Verteilung des Moco auf die Mo-Enzyme. Im Rahmen dieses Projektes fanden wir eine neue Genfamilie, deren 8 Mitglieder für Proteine codieren, die Moco binden können. Wir haben alle Proteine der Familie im Cytoplasma lokalisiert, recombinant exprimiert, gereinigt und biochemisch charakterisiert: Es handelt sich um Moco-Bindeproteine mit einem kD-Wert von 1 - 5 µM. Wir nennen diese Proteine deshalb Moco-Binding Proteins (MoBP). Während wir schon sehr viel zur Biosynthese des Moco wissen, liegen die Prozesse jenseits der Cofaktosynthese weitgehend im Dunkeln. Wir haben deshalb - aufbauend auf dem vorliegenden Projekt - der DFG vorgeschlagen, eine Forschergruppe einzurichten, die sich mit Transport und Insertion von prosthetische Gruppen in ihre Zielproteine beschäftigt. Diesem Antrag wurde stattgegeben: FOR 1220 "Prosthetic groups - transport and insertion (PROTRAIN)" startete im Sommer 2009.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2007). Metal and cofactor insertion. Nat. Prod. Rep. 24, 963-971
Mendel, R.R., A.G. Smith, A. Marquet, M.J. Warren
- (2009) Molybdenum cofactors, enzymes and pathways. Nature 460, 839-847
Schwarz G., Mendel R.R. & Ribbe M.W.
- (2009) New GATEWAY- vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by Bimolecular Fluorescence Complementation. Molecular Plant 2, 1051 - 1058 (2009)
Gehl C, Waadt R, Kudla J, Mendel R and Hänsch R
- Identification and biochemical characterization of molybdenum cofactor-binding proteins from Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem.
Tobias Kruse, Mirco Geisler, Markus Lehrke, Phillip Ringel, Christian Gehl, Robert Hänsch, and Ralf R. Mendel
