Molekulare Analyse der Interaktion des humanen Nukleotid-Rezeptors P2Y11 mit selektiven Liganden
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Der humane P2Y11-Rezeptor war nur ungenügend erforscht, was uns zur Untersuchung einiger Kernfragen der physiologischen Charakteristik dieses Rezeptors motivierte. In Anbetracht der weiten Verbreitung des Rezeptors in menschlichen Geweben und dessen vermuteter Rolle in Antworten des Immunsystems sind die von uns gewonnenen Daten für künftige pharmakologische und biochemische Untersuchungen und medizinische Anwendungen wichtig. Die von uns gewonnenen Daten haben sich für den Fortschritt im Verständnis des molekularen Mechanismus der Nukleotid-P2Y Rezeptor-Interaktion und der pharmakologischen Charakteristika des humanen P2Y11-Rezeptors als wesentlich herausgestellt. In Kooperation mit Dr. B. Fischer (Institut für Chemie, Bar-Ilan Universität, Ramat-Gan, Israel) konnten wir wichtige Erkenntnisse für das Design von P2Y11-Rezeptor-spezifischen Nukleotiden gewinnen und publizieren. Im Rahmen des DFG-Projektes wurden folgende neuartige zellbiologische Eigenschaften des P2Y11 Rezeptors gefunden. Rezeptorinternalisation: Eine Internalisierung des P2Y11 Rezeptors kann in 1321N1 Astrozytoma-Zellen, welche keine weiteren P2Y-Rezeptoren exprimieren, nicht beobachtet werden. Wenn der Rezeptor aber in HEK293-Zellen exprimiert ist wird der P2Y11 Rezeptor nach Aktivierung internalisiert. HEK293-Zellen besitzen zusätzlich endogene und zur Internalisation befähigte P2Y1-Rezeptoren. Der P2Y11-Rezeptor zeigt dann auch eine völlig veränderte pharmakologische Charakteristik. Nicht der P2Y11-Rezeptor spezifische Antagonist, sondern nur ein P2Y1-Rezeptorspezifischer Antagonist ist in der Lage, die Calciumantwort und die P2Y11-Rezeptorinternalisation zu inhibieren. Ferner sind P2Y1-Rezeptor spezifische, nicht aber P2Y11-Rezeptor-spezifische Nukleotide in der Lage die Internalisation auszulösen. Rezeptor-Hetero-Oligomerbildung: Wir konnten zeigen, dass die P2Y1- und P2Y11-Rezeptoren in HEK293-Zellen interagieren und Hetero-Oligomere bilden, was zur beobachteten veränderten Charakteristik des P2Y11-Rezeptors führt. Demnach kommen Untersuchungen des P2Y11-Rezeptors in solchen Zellen den physiologischen Bedingungen der humanen Multi-Rezeptor-Umgebungen näher als die Rezeptoren in Zellen ohne endogenen P2Y-Rezeptor Hintergrund. Im Rahmen des Projektes konnten wir Aminosäuren des Rezeptors identifizieren, die für die von uns publizierte Diastereoselektivität und für die generelle Aktivierbarkeit der Rezeptoren kritisch sind. Diese Ergebnisse erweitern unsere Daten über die Nukleotid-Bindetasche des Rezeptors und werden damit entscheidenden Einfluss auf das Design neuer Agonisten und Antagonisten haben. Neuer zusätzlicher Aspekt – Medizinische Bedeutung des P2Y11-Rezeptors: Der A87T Single-Nucleotid-Polymorphismus wurde statistisch mit einem erhöhten Herzinfarktrisiko in Zusammenhang gebracht. Somit besteht ein möglicher klinischer Zusammenhang zu Atherosklerose. Unsere weiteren Ergebnisse ergaben allerdings in 1321N1-Zellen keine veränderte Liganden-Potenz am P2Y11A87T-Rezeptor. In HEK293-Zellen jedoch ist die ATP-Potenz wesentlich reduziert. Gleiches gilt für die Potenz des P2Y11-Rezeptor spezifischen Agonisten BzATP und für 2-MeS-ADP, einem auch für P2Y1-Rezeptor spezifischen Agonisten. Der A87T-SNP verhindert ferner eine nukleotid-induzierte Internalisierung des Rezeptors, was zu einer schnelleren Resensitivierung des Rezeptors führt. Um zu erforschen, ob die Veränderung der Polarität oder Größe der Aminosäure die Ursache für die veränderten Eigenschaften des P2Y11A87T-Rezeptors darstellt, haben wir weitere Rezeptormutanten (A87S) generiert. In HEK293-Zellen kann hier ebenfalls keine Internalisation gefunden werden. Der Rezeptor weist aber gegenüber dem P2Y11A87T-Rezeptor eine verstärkte Calciumantwort auf. Diese Erkenntnisse über die molekulare Struktur des P2Y11-Rezeptors werden von uns weiter im Detail erforscht und für anspruchsvolle Publikationen vorbereitet. Ausblick: Unsere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Auswirkungen des A87T-Polymorphismus auf veränderte Eigenschaften des Rezeptor-Oligomers (wohl P2Y1/P2Y11) zurückzuführen sind. Da Makrophagen und dendritische Zellen beide Rezeptor-Subtypen besitzen und eine relevante Rolle für die Bildung von Atherosklerose spielen, hypothetisieren wir eine wichtige Funktion des Rezeptor-Oligomers in der Pathogenese. Wir erwarten daher einen bedeutenden Einfluss unserer Ergebnisse auf die zukünftige medizinische Forschung und Anwendung bezüglich der Nukleotid/ P2Y11-Rezeptorwirkung. Unsere Arbeit hat außerdem die Förderung eines weiteren Drittmittel-Projektes ermöglicht (GIF- gefördert; Thema: Neuroprotektion und ROS-Scavenging durch P2Y1-Rezeptoren).
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Diastereoselectivity of the P2Y11 nucleotide receptor: mutational analysis. Br. J. Pharmacol. (2008A), 155, 1250 - 1255
Ecke D., Fischer B., Reiser G.
- Heterooligomerization of the P2Y11 receptor with the P2Y1 receptor controls the internalization and ligand selectivity of the P2Y11 receptor. Biochem. J. (2008B), 409, 107–116
Ecke D., Hanck T., Tulapurkar M.E., Schäfer R., Kassack M., Stricker R., Reiser G.
- (2010). 5-OMe-UDP is a potent and selective P2Y6-receptor agonist. J. Med. Chem. 53:1673–1685
Ginsburg-Shmuel T, Haas M, Schumann M, Reiser G, Kalid O, Stern N, Fischer B
- Diadenosine 5',5''-(boranated)polyphosphonate analogues as selective nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase inhibitors. J. Med. Chem. (2010), 53, 8485-8497
Eliahu S., Lecka J., Reiser G., Haas M., Bigonnesse F., Levesque S.A., Pelletier J., Sevigny J., Fischer B.
