Die Funktion von Aktin im γ-TuRC

• Antragsteller: Dr. Stefan Pfeffer; Professor Dr. Elmar Schiebel
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 506671472

Die regulierte Assemblierung von Mikrotubuli (MT) wird in Wirbeltieren vor allem durch den γ-Tubulin Ring Komplex (γ-TuRC) vermittelt. Der γ-TuRC besteht aus fünf paralogen GCP Proteinen (GCP2 bis GCP6), γ-Tubulin, Aktin, und den zwei kleinen Proteinen MZT1 (mitotic spindle organizing protein 1) und MZT2. Vor kurzem haben wir die Struktur des γ-TuRC mittels hochauflösender Kryo-Elektronenmikroskopie gelöst. Die GCP Untereinheiten sind in einer definierten Reihenfolge und Stöchiometrie angeordnet und bilden eine offene linkshändige Spirale aus 14 γ-Tubulin/GCP Heterodimeren aus. Die γ-Tubulin Untereinheiten an Position 1 und 14 überlappen entlang der MT Achse, so dass nur 13 γ-Tubulin Moleküle zugänglich sind und folglich als strukturelle Vorlage für die Nukleation von MT mit exakt 13 Protofilamenten dienen. Innerhalb des γ-TuRC befindet sich eine stabilisierende Struktur, die ‚lumenale Brücke‘, bestehend aus zwei Kopien von MZT1 im Komplex mit den N-termini von GCP6 und GCP3, sowie – überaschenderweise – einer Kopie von Aktin. Obwohl Aktin tief in die Struktur eingebettet ist, gibt es mögliche Interaktionsflächen für Proteine, die γ-TuRC-assoziiertes Aktin erkennen und dadurch die Lokalisation und Aktivität des γ-TuRC regulieren könnten.Mit diesem Antrag wollen wir die Funktion von Aktin im γ-TuRC verstehen. 1) Die Struktur des von uns rekombinant hergestellten Aktin-defizienten γ-TuRC zeigt eine geöffnete Konformation des Komplexes, bei dem potentiell 14 γ-Tubulin Moleküle exponiert sind. Wir wollen deshalb testen, ob Aktin-defizienter γ-TuRC MT mit einer abweichenden Protofilament Anzahl bildet. 2) Lichtmikroskopie in Kombination mit hochauflösender Abbildung über Kryo-Elektronen Tomographie wird es uns erlauben Wildtyp und Aktin-defizienten γ-TuRC mit hoher Genauigkeit zu lokalisieren und ihre Konzentration, Verteilung und Struktur im zellulären Kontext zu beschreiben. 3) Um Aktin-abhängige Änderungen in der Zusammensetzung des γ-TuRC zu verstehen, werden wir Wildtyp und Aktin-defizienten γ-TuRC mittels Massenspektrometrie analysieren. Zudem werden wir testen, ob γ-TuRC-assoziiertes Aktin mit einem Pool von freiem Aktin austauschen kann und ob ATP Hydrolyse durch Aktin wichtig für die Funktion des γ-TuRC ist. 4) Durch bioinformatische Analyse von GCP6 Sequenzen und Interaktionsstudien werden wir analysieren wann in der Evolution Aktin in den γ-TuRC integriert wurde (bzw. verloren ging). Von besonderem Interesse ist Drosophila, wo eine der Hauptkomponenten der lumenalen Brücke, MZT1, nur Gewebe-spezifisch exprimiert wird, was die Frage aufwirft, ob und wie Aktin in den γ-TuRC verschiedener Drosophila Gewebe integriert wird. Cryo-EM Analyse des rekombinant exprimierten und aufgereinigten Drosophila γ-TuRC mit und ohne MZT1 wird darüber Aufschluss geben.Durch die Kombination von Biochemie und Zellbiologie mit innovativen Strukturbiologiemethoden werden wir zusammenfassend zentrale Fragen zur Funktion von Aktin im γ-TuRC beantworten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen