Live-Cell-Bildgebungssystem

• Fachliche Zuordnung: Grundlagen der Biologie und Medizin
• Förderung: Förderung in 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 506524377

Hier beantragen wir ein Bildgebungssystem für lebende Zellen, das die Vermehrung und das Absterben von lebenden Zellen über einen längeren Zeitraum visuell aufzeichnet. Dies ermöglicht eine viel genauere Charakterisierung beider Prozesse im Vergleich zu den derzeit verwendeten Assays, die eine Momentaufnahme zu einem festen Zeitpunkt liefern. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass diese höhere Präzision erforderlich ist, um genau zu beschreiben, wie Zellen auf äußere Reize oder auf genetische Manipulationen reagieren. Alle Antragsteller arbeiten in der Tumor- oder Zellbiologie, und die genaue Charakterisierung der Zellproliferation, des Zellzyklus und des Zelltods steht im Mittelpunkt praktisch aller Projekte in den Labors der Antragsteller. Dazu nutzen die Antragsteller eine gut etablierte Infrastruktur: Wir verwenden FACS-Analysen markierter Zellen, um die Zellzahl, den DNA-Gehalt, den Verlauf der S-Phase und die Apoptose zu überwachen. Für Langzeitbeobachtungen der Zellzahl verwenden wir eine Kombination aus Zellzählgeräten und Kristallviolettfärbung von Platten. Hier beantragen wir ein Bildgebungssystem für lebende Zellen, das die Aufnahme von Zeitraffervideos und die Überwachung der Zellzahl und optischer Parameter über einen Zeitraum von mehreren Tagen auf nichtinvasive Weise ermöglicht. Dies ist möglich, da das Bildgebungsinstrument selbst in einem Gewebekultur-Inkubator untergebracht sein wird.Die Anforderungen an die präzise Dokumentation von Vermehrung und Absterben von Zellen nehmen ständig zu, und viele Laboratorien verwenden inzwischen Bildgebungssysteme für lebende Zellen. Nach der Erprobung dieser Geräte ist uns klar geworden, dass die Analyse des Zellverhaltens mit diesen Geräten viel präziser ist als jede Methode, die wir bisher verwendet haben. Dies hat mehrere zentrale Gründe:• Für jede Bedingung liefert die ständige Beobachtung mehrere Datenpunkte, so dass der Fehler bei der Beschreibung von Wachstumsraten oder anderen quantitativen Parametern viel geringer ist als bisher. Infolgedessen sind alle Aussagen über Unterschiede zwischen zwei Versuchsbedingungen viel präziser.• Heterogenität zwischen Zellen wird während des Experiments sofort sichtbar. Wir verwenden zum Beispiel lentivirale Pool-Infektionen von shRNA- oder sgRNA-exprimierenden Vektoren, um Proteine zu depletieren. In diesen Vektoren ist die Expression der sh/sgRNA mit einem GFP-Marker verbunden. Die langfristige Beobachtung der GFP-Expression parallel zum Zellwachstum ermöglicht es uns festzustellen, ob Zellen die vollständige oder teilweise Expression von shRNA/GFP beibehalten, so dass wir Rückschlüsse auf den Selektionsdruck durch sg/shRNA ziehen können.• Die parallele Beobachtung des Zelltods ermöglicht klare Aussagen darüber, ob die Manipulation einen pro-apoptotischen Phänotyp ausübt.• Schließlich erleichtert die bessere Dokumentation die Veröffentlichung der Daten erheblich, indem sie die Anforderungen an die statistische Dokumentation erfüllt.

• DFG-Verfahren: Forschungsgroßgeräte
• Großgeräte: Live-Cell-Bildgebungssystem
• Gerätegruppe: 5040 Spezielle Mikroskope (außer 500-503)
• Antragstellende Institution: Julius-Maximilians-Universität Würzburg
• Leiter: Professor Dr. Martin Eilers