Biochemische und strukturbiologische Analyse des NLRP3 Inflammasomes

• Antragsteller: Professor Dr. Matthias Geyer
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 504829198

Der Mensch besitzt ein sehr wirksames und komplexes Immunsystem, um Krankheitserregern entgegenzuwirken, die seine Gesundheit bedrohen. Das angeborene Immunsystem ist in der Lage durch spezifische Rezeptoren, die molekulare Muster erkennen, zwischen Eigen- und Fremd-Molekülen zu unterscheiden. Inflammasome sind zytosolische Multiproteinkomplexe, die sich als Reaktion auf eine Vielzahl von Krankheitserregern, Gewebeschäden und anderen schädlichen Stimuli bilden und eine Immunantwort auslösen. Mitglieder der Familie der NOD-ähnlichen Rezeptoren (NLRs) nehmen diese pathogenen und gefahrbezogenen molekularen Muster wahr, was zu ihrer Aktivierung und Oligomerisierung führt. Das NLRP3 Protein ist der prominenteste inflammasomale Rezeptor, der auf eine breite Palette von Stimuli reagiert und an multiplen autoinflammatorischen Krankheiten beteiligt ist. Die strukturellen Grundlagen der Inflammasomenfunktion und der molekulare Übergang von einem autoinhibierten in einen aktivierten Zustand sind jedoch nur unzureichend verstanden.In Vorarbeiten haben wir das humane, voll-längen NLRP3 Protein mittels Affinitäts-chromatographie aus Baculo-Virus infizierten Insektenzellen gereinigt. Überraschenderweise eluiert das Protein bei einer Größe von 1,15 MDa, was auf eine große, oligomere Anordnung hinweist. Mit Hilfe der Einzelpartikel-Kryo-EM haben wir die Struktur von NLRP3 im inaktiven Zustand, gebunden an den Inhibitor CRID3, bei einer Auflösung von 3,9 Ang bestimmt. ADP-gebundenes NLRP3 ist ein Dekamer, das aus Homodimeren ineinander verflochtener LRR-Domänen besteht, die sich ringförmig zu Pentameren zusammenfügen. Die NACHT-Domäne befindet sich an der apikalen Achse dieser kugelförmigen Struktur. Wir wollen in diesem Forschungsvorhaben zwei Hauptziele ansprechen: (1) Die Kryo-EM-Strukturbestimmung des oligomeren NLRP3-Komplexes im aktiven Zustand und (2) die funktionelle Charakterisierung der verschiedenen Konformationszustände von NLRP3 mittels biochemischer Methoden. Neben modernsten Methoden der Kryo-EM-Bildgebung und der Strukturrekonstruktion sollen die Forschungsziele in acht Arbeitspaketen erreicht werden. Dazu gehören die Überführung des NLRP3-Dekamers in einen aktiven Zustand, die Auswirkungen der Kinase NEK7 auf die Konformationszustände von NLRP3, der Aufbau eines NLRP3-stimulierten ASC-Filament-Seeding-Assays, die strukturelle und funktionelle Charakterisierung einer membranassoziierten NLRP3-Spezies, die Analyse der ATP-Hydrolyse, die Charakterisierung von Krankheitsmutationen und Autoinhibition, die Interaktion mit Modellmembranen und die Überwachung von Konformationsänderungen bei in vitro-Phosphorylierung von NLRP3. Diese Analysen werden dazu beitragen, die Struktur-Funktions-Beziehung von NLRP3 aufzuklären und Einblicke in die Konformationszustände dieses medizinisch wichtigen Inflammasoms zu erhalten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen