Untersuchung der DNA-Interaktionsspezifität von DNA-Methyltransferasen und -Demethylasen mittels „Deep-Enzymology

• Antragsteller: Professor Dr. Albert Jeltsch
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 498335429

DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Genexpression, genomischer Stabilität, Zelldifferenzierung und der Entwicklung von Säugern. Sie wird durch DNA-Methyltransferasen (DNMTs) eingeführt und aktive Demethylierung wird durch die Oxidation von 5-Methylcytosin durch Ten-Eleven-Translokation (TET) - Methylcytosindioxygenasen ausgelöst. Wie viele andere DNA interagierende Enzyme müssen DNMTs und TETs ihre Zielsequenzen (CpG in den meisten Fällen) in verschiedenen Sequenzkontexten identifizieren, was eine schwierige und nicht gut verstandene Aufgabe ist. Um den Einfluss flankierender Sequenzen auf die Erkennung von Zielsequenzen zu untersuchen und die Sequenzpräferenzen von DNMTs detailliert zu bestimmen, haben wir einen neuartigen „Deep Enzymology“ Ansatz entwickelt. Dabei wird ein Pool von DNA-Substraten erzeugt, die eine (modifizierte) Zielstelle enthalten, welche beidseitig von 10 randomisierten Nukleotiden flankiert wird. Der Substratpool wird methyliert und durch Bisulfitkonvertierung gefolgt von NGS analysiert. Auf diese Weise wird der Methylierungszustand einzelner Produktmoleküle mit ihren flankierenden Sequenzen bestimmt. Unsere bisherigen Studien haben dokumentiert, dass dieser Ansatz sehr leistungsfähig ist und neue und wichtige mechanistische Details aufdeckt, sowie dass Flankierungssequenz-Präferenzen von DNMTs mit zellulären DNA Methylierungsprofilen korrelieren. Hier planen wir, diese Technologie zu verwenden, um die Präferenzen für Flankierungssequenzen ausgewählter Enzyme zu untersuchen, die an der DNA-Methylierung beteiligt sind. Wir planen Human- und Maus-DNMT3B, DNMT3C (ein in Mäusen und Nagetieren identifiziertes DNMT3B-Paralog) und DNMT1 untersuchen und feststellen, inwieweit die Flankierungssequenz-Präferenzen dieser Enzyme den Sequenzen von characteristischen biologischen Substraten entsprechen, die in allen Fällen spezifische repetitive Elemente sind. Zwei pflanzliche Methyltransferasen (DRM2 mit CHH-Spezifität und CMT3 mit CNG-Spezifität) sollen untersucht und die experimentellen Flankierungssequenz-Präferenzen mit DNA-Methylierung in Pflanzenzellen verglichen werden. Wir werden unsere Methode zur Analyse der Methylcytosin-Oxidation anpassen und anwenden, um die Flankierungssequenz-Präferenzen von humanen TET-Enzymen zu untersuchen, die dann mit Hydroxymethylierungsmustern in genomischer DNA verglichen werden sollen. Schließlich planen wir, einen Deep Enzymology Ablauf zu entwickeln, um die RNA-Methylierung zu untersuchen und auf DNMT2 anzuwenden, eine tRNA-Asp Methyltransferase mit unklarem Spektrum an weiteren Substraten. Wir haben Kooperationen mit führenden Experten weltweit geschlossen, um die biologischen Konsequenzen unserer Erkenntnisse weiterzuverfolgen. Wir erwarten, dass unser Projekt bahnbrechende Einblicke in die Mechanismen dieser wichtigen Enzyme liefert und unser Verständnis ihrer grundlegenden Rolle im Prozess der DNA-Methylierung und -Demethylierung vertieft.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen