The role of a temporal expressed protein disulfide isomerase in the circadian clock of the green alga Chlamydomonas reinhardtii
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Vorhandensein der gesamten Genomsequenz von Chlamydomonas reinhardtii, ihre problemlose Anzucht und die hervorragende Zugänglichkeit für biochemische Aufreinigungsmethoden haben den Weg geebnet für funktionelle Proteomanalysen. Mit einer Kombination aus Heparin-Affinitäts-Chromatographie, zwei-dimensionaler Gelelektrophorese und Massenspektrometrie konnten wir eine Protein Disulfid Isomerase (CrPDI2) identifizieren, die in besonders hohem Maße aus in der subjektiven Nacht entnommenen Proben durch Heparin aufgereinigt werden konnte. Protein Disulfid Isomerasen spielen eine wichtige Rolle bei der korrekten Faltung neu synthetisierter Proteine und bei der Bildung von Disulfidbrücken. Um die Funktion der CrPDI2 innerhalb des circadianen Systems zu studieren, haben wir deren cDNA überexprimiert. In zwei transgenen Stämmen konnten wir mit Hilfe der automatisierten Messung der Phototaxis eine Veränderung der Acrophase beobachtbar. Das Maximum der Phototaxis trat zu Beginn des der Tagphase auf anstatt in der Mitte des subjektiven Tages. Wir konnten zeigen, daß die rekombinante CrPDI2 ein Redox-aktives Protein ist. Sie kann von der Thioredoxin-Reduktase reduziert werden und katalysiert ihrerseits die Reduktion von Insulin. Außerdem fanden wir heraus, dass die rekombinante CrPDI2 eine oxidative Rückfaltungsaktivität besitzt, welche denaturierte RNAse A wieder in ihre native und aktive Form überführt. Unter Benutzung von Peptidantikörpern haben wir, im Gegensatz zum Rohextrakt, eine 5-fache circadiane Veränderung der Abundanz der Heparin-gebundenen CrPDI2 ermittelt. Dies legt nahe, daß sie spezifische Interaktionspartner während der Nacht haben könnte, welche für den beobachteten Unterschied verantwortlich sind. Tatsächlich konnten wir zeigen, daß die CrPDI2 in Komplexen unterschiedlicher Größe während der Nacht und dem Tag vorliegt und identifizierten einen Interaktionspartner (ein 2-Cys Peroxiredoxin, CrPRX2), welcher spezifisch während der Nacht vorliegt. Um die Art ihrer Interaktion näher zu bestimmen, haben wir die mittleren Redoxpotentiale für die CrPDI2 und CrPRX2 bei pH 7 bestimmt. Da beide Proteine ein sehr ähnliches Redoxpotential aufweisen und damit eine sehr ähnliche Reduktionskraft besitzen, ist es unwahrscheinlich, dass ihre Interaktion auf Redoxreaktionen beruht. Studien zur Bestimmung der Lokalisation innerhalb der C. reinhardtii-Zellen mit Hilfe von Immunofluoreszenz und Westernanalysen von isolierten Chloroplasten zeigten, dass die CrPRX2 hauptsächlich im Cytosol lokalisiert ist, während die CrPDI2 im Chloroplasten vorhanden ist. Da die Zellen für diese Analysen am Tag geerntet wurden, wäre es von großem Interesse herauszufinden, ob die Lokalisierung beider Proteine in der Nacht, wenn sie interagieren, verändert ist. Eine Möglichkeit, dies zu bestimmen, wäre die Isolation von Chloroplasten aus Zellen, welche zu unterschiedlichen LL Zeitpunkten geerntet wurden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2013) Protein disulfide isomerase 2 of Chlamydomonas reinhardtii is involved in circadian rhythm regulation. Mol Plant. 6, 1503-1517
Filonova A., Haemsch P. Gebauer C., Weisheit W. and Wagner V.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1093/mp/sst048)
