Funktionsanalyse der Interaktionen des SARS-CoV-2-Genoms mit microRNAs und Virus-Inhibition mittels zirkulärer RNAs als neuartiges Therapiekonzept

• Antragsteller: Dr. Oliver Roßbach
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Virologie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 465346560

Die Molekularbiologie des Coronavirus SARS-CoV-2, der Ursache der COVID-19-Pandemie, wirft nach wie vor viele Fragen auf. Die zellulären Rezeptoren, welche für das Eindringen des Virus benötigt werden, sind zwar bekannt, doch muss eine Vielzahl zellinterner Gegebenheiten und Faktoren vorliegen, so dass das Virus effizient repliziert und eine ausreichend hohe Virenlast produziert um andere Zellen, Gewebe oder Individuen zu infizieren. Dies erklärt warum SARS-CoV-2 in vielen Geweben mit passenden Rezeptoren nicht repliziert.Wir wollen in diesem Forschungsvorhaben einen der Mechanismen aufklären, der dazu beiträgt, dass SARS-CoV-2 nur einige Zelltypen produktiv infiziert. Dazu werden wir die Interaktionen viraler RNAs mit zellulären microRNAs (miRNAs) untersuchen, und dann als Therapieansatz für das Virus essentielle Interaktionen stören, um die Replikation zu inhibieren. Bei miRNAs handelt es sich um kleine zelluläre RNAs, die durch mRNA-Bindung die Expression zelleigener Proteine regulieren. Für einige RNA-Viren wie z.B. das Hepatitis-C-Virus (HCV) konnte gezeigt werden, dass bestimmte miRNAs bei Vireninfektion zweckentfremdet werden, an die virale RNA binden und für die Viren-Vermehrung essentiell sind. SARS-CoV-2 ist wie HCV ein Positivstrang-RNA-Virus, dessen RNA-Genom im Zytoplasma repliziert sowie eine Vielzahl viraler Proteine exprimiert. Wahrscheinlich ist das Vorhandensein bestimmter miRNAs zu einem großen Teil dafür verantwortlich ist, dass dies effizient geschehen kann.Um solche miRNA-Virus-Interaktionen zu identifizieren, werden wir zuerst durch Sequenzierung die miRNA-Zusammensetzung der Zelltypen bestimmen, in denen SARS-CoV-2 effizient repliziert. Mit Hilfe dieses Datensatzes werden wir dann durch bioinformatische Analysen potentielle Bindungsstellen abundanter miRNAs auf dem SARS-CoV-2-Genom vorhersagen. Parallel dazu wird die CLIP-Technologie (crosslinking and immunoprecipitation) eingesetzt, um miRNA/SARS-CoV-2 Interaktionen experimentell zu erfassen. Beim CLIP wird ein bestimmtes Protein aufgereinigt, und alle daran gebundenen RNAs sequenziert. In diesem Fall wird CLIP in SARS-CoV-2-infizierten Zellen mit dem miRNA-assoziierten Protein Ago2 durchgeführt. So können wir Komplexe aus miRNAs und viraler RNA aufreinigen, sequenzieren, und somit herausfinden wo auf dem Virus-Genom oder den sub-genomischen viralen mRNAs die miRNAs binden und welche Funktion ihnen dabei zukommen könnten. Die für den SARS-CoV-2 Replikationszyklus essentiellen Interaktionen werden wir dann gezielt stören, indem wir die miRNAs mit konkurrierenden künstlich hergestellten zirkulären RNAs inhibieren. Eine solche indirekte Virus-Inhibition als neuartige antivirale RNA-Therapie-Strategie hatten wir zuvor bereits am Modellsystem HCV demonstriert. Die Kartierung der miRNA-Virus-Interaktionen könnte viele andere Gruppen bei der Erforschung der Molekularbiologie und Pathogenese von SARS-CoV-2 unterstützen und neuartige Therapiemöglichkeiten auftun.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen