Phosphorylierungsabhängigkeit von Proteinen der zentralen Schicht der "Core-Struktur" bei der Centrosomduplikation von Dictyostelium Amöben.

• Antragsteller: Professor Dr. Ralph Gräf
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 463103716

Dictyostelium-Amöben sind zur Untersuchung basaler, Centriol-unabhängiger Prozesse am Centrosom sehr geeignet, da sie außerhalb der Opisthokonta der einzige Modellorganismus mit centriolfreien Centrosomen sind. Ziel ist es, die molekularen Mechanismen aufzuklären, die bei der Verdoppelung dieses Centrosomentyps eine Rolle spielen. Schlüsselereignis beim G2/M-Übergang ist die Aufspaltung seiner dreilagigen Zentralstruktur, wobei die mittlere Lage, die aus CP39, CP75 und CP91 besteht, verschwindet. Alle drei Proteine sind potentielle Ziele für mitotische Kinasen. Basierend auf Ergebnissen aus anderen Organismen und bekannten BioID-Protein-Protein-Interaktionen kommen Plk, CDK1 und Nek2 als regulatorische Kinasen in Frage. Mit diesem Projektantrag wollen wir klären, welche dieser Kinasen welches der drei Centrosomproteine phosphoryliert und wir werden die Konsequenzen dieser Phosphorylierungen auf ihre spezifischen Protein-Protein-Interaktionen analysieren.- Wir werden Punktmutanten von CP39, CP75 und CP91 als GFP-Fusionsproteine exprimieren und uns dabei auf jene Subdomänen konzentrieren, die bekanntermaßen an ihrer mitotischen Regulation beteiligt sind. Durch multiple phosphorylierungsrelevante Punktmutationen sollten wir herausfinden, welche Phosphorylierungsstellen in den drei Proteinen für ihre Dissoziation von mitotischen Centrosomen erforderlich sind. - Hinsichtlich CDK1 werden wir auch den Effekt von Punktmutationen in der Centrosomenbindungsdomäne von Cyklin B untersuchen.- Plk, CDK1 und Nek2 werden in vitro Kinaseassays als echte Modifikatoren der identifizierten Phosphorylierungsstellen verifiziert, wobei die rekombinanten Kinasen aus dem autologen Wirt verwendet werden. In diesem Zusammenhang werden wir eine neue Methode zur M-Phasen-Synchronisierung des Zellzyklus in Dictyostelium etablieren, bei der die endogene CDK1 durch eine CDK1-Mutante ersetzt wird, die durch ein ATP-Analogon reversibel blockiert werden kann. - Massenspektrometrische Identifizierung von in vivo Phosphorylierungsstellen: Kontrollzellen und Stämme, die dominant-negative Varianten der drei Kinasen exprimieren, werden verglichen.- Wirkung von phosphomimetischen Mutationen von CP39, CP75 und CP91 auf Protein-Wechselwirkungen: BioID-Interaktionen und die Copräzipitation von GFP-markierten CP39-, CP75- und CP91-Proteinen mit bekannten coexprimierten, His-Myc markierten Bindungspartnern werden untersucht. Für Studien auf mikroskopischer Ebene werden wir in einem Fehllokalisationsassay eine gezielte Fehllokalisation der drei Centrosomproteine und ihrer Phosphomutanten an den Zellkortex herbeiführen. Eine entsprechende Colokalisation der Bindungspartner belegt dabei die Protein-Wechselwirkung. Außerdem werden wir untersuchen, ob die Expression der punktmutierten Proteine Veränderungen in der mitotischen centrosomalen Lokalisation ihrer Bindungspartner bewirkt, was ebenfalls eine Abhängigkeit der gegenseitigen Wechselwirkungen vom Phosphorylierungszustand zeigen würde.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen