Architektur und Dynamik von Proteinkomplexen an Membrankontaktstellen der vakuolären Membran

• Antragstellerinnen: Dr. Ayelen Gonzalez Montoro; Professorin Dr. Fan Liu
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 453234580

Membrankontaktstellen (membrane contact sites, MCS) sind spezialisierte Domänen an denen die Membranen zweier Organellen in räumlicher Nähe zueinander verankert werden. Diese Domänen dienen als Plattform, die den Austausch von Molekülen ermöglichen und die Dynamik der Organellen beeinflussen. Daher spielen Membrankontaktstellen eine entscheidende Rolle in der Koordination der metabolischen Prozesse einer Zelle. Trotz dieser erheblichen Wichtigkeit sind weder die Prozesse die zur Entstehung, noch die Zusammensetzung oder Funktionalität von Membrankontaktstellen hinreichend untersucht. In dem beantragten Projekt fokussieren wir uns auf die Membrankontaktstellen der Vakuole. Die Vakuole der Hefe Saccharomyces cerevisiae recycelt Makromoleküle, die durch Endozytose oder Autophagie in ihr Lumen gelangen, so dass die einzelnen Bausteine und Nährstoffe der Zelle wieder zur Verfügung stehen. Die Vakuole dient zudem als Speicherorganell und trägt entscheidend zu intrazellulären Signalwegen bei und reguliert die zytosolische Konzentration von zahlreichen kleinen Molekülen. Wir beabsichtigen Crosslinking Massenspektrometrie (XL-MS) als unser Hauptwerkzeug zu nutzen, um die molekulare Architektur und die Dynamik von Proteinkomplexen der vakuolären Membrankontaktstellen zu untersuchen. Um ein umfassendes Interaktom der vakuolären Membran zu bestimmen, werden wir die bestehende XL-MS Methodik weiterentwickeln, indem wir einen Workflow etablieren, der auf einem neuen, anreicherbaren MS-cleavable Crosslinker basiert. Wir werden zusätzlich die Detektion von MCS-Proteinen verbessern, indem wir auf Überexpressionsstämme zurückgreifen, in denen spezifische Kontaktstellen häufiger auftreten. Um die Funktionsweise der neu identifizierten Komponenten und damit der Membrankontaktstelle zu untersuchen, werden wir diese mit einer Reihe an komplementären Methoden charakterisieren. Zu diesen gehören fluoreszenzmikroskopische, biochemische, strukturbiologische und genetische Techniken. Abschließend werden wir durch vergleichen des Interaktoms von Vakuolenpräparationen aus Zellen, die unter verschiedenen Wachstumsbedingungen angezogen wurden, untersuchen, welche Änderungen in der Maschinerie der Membrankontaktstellen durch einen Wechsel im zellulären Metabolismus auftreten. Durch diese Studien wird eine entscheidende Wissenslücke im Bereich der Membrankontaktstellen geschlossen und wichtige Einsichten in die molekulare Maschinerie und die Dynamik vakuolärer Kontaktstellen gewonnen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen