Regulation des Replikationsorigin-Firings in Metazoenzellen zur Sicherung der Genomstabilität

• Antragsteller: Professor Dr. Dominik Boos
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 448973587

Dieses Projekt erforscht die Regulation des Origin-Firings - der Generierung von Replikationsgabeln - in Metazoen. Origin-Firing Regulation ist in teilungsaktiven Zellen sowohl in normalen Wachstumsbedingungen als auch nach DNA Schäden für exakte Genomduplikation zentral, um genetische Krankheiten und Krebs zu vermeiden. Bei normalem Wachstum müssen genügend Origins zeitlich-räumlich genau reguliert feuern, um das Genom vollständig zu duplizieren. Nach DNA Schäden wird die Replikation durch Inhibition des Firings gehemmt, um Kopierfehlern vorzubeugen. Unsere Arbeit half, den MTBP-Treslin-TopBP1 Proteinkomplex als Regulationsplattform des Origin-Firings zu etablieren (Boos et al. 2011, 2013). Wir identifizierten MTBP als Firing-Faktor (Boos et al. 2013) und studierten MTBP im Detail (Köhler et al. 2019): MTBP besitzt konservierte Origin-Firing Funktionen, die durch die zu dem Hefeprotein Sld7 homologen N- und C-terminalen MTBP Proteindomäne vermittelt werden. MTBP besitzt aber auch Metazoen-spezifische Replikationsfunktionen, vermittelt durch die nicht in Hefe konservierte MTBP-Mitteldomäne. Eine dieser Funktionen benötigt die Bindung an die Cdk8-cyclin C Kinase (CDK8 Kinase), die bisher nur als Transkriptions-regulatorische Kinase bekannt war.In diesem Projekt verfolgen wir zwei Ziele:Ziel A) Klärung der zellulären Funktion und der molekularen Mechanismen der Kooperation von MTBP mit CDK8 bei der Origin-Firing Regulation.Vorläufige Ergebnisse zeigen eine Rolle von CDK8 bei der Etablierung des Genomreplikationsprogramms, die unabhängig von der CDK8 Transkriptionsfunktion ist. Wir werden die genaue Rolle von CDK8 bei der Replikation klären, CDK8 Kinasesubstrate identifizieren, sowie die molekularen Mechanismen erforschen.Ziel B) Die Erforschung eines neuen Signalwegs zur Origin-Firing Inhibition - der Inhibition von MTBP durch Phosphorylierung.Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass MTBP Phosphorylierung an der Firing-Inhibition nach DNA Schäden beteiligt sein könnte. Überraschenderweise stießen wir auch auf eine Rolle beim Genomreplikationsprogramm in nicht geschädigten Zellen. Wir werden die genaue Funktion und die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen klären.Unser Ansatz ist, in kultivierten menschlichen Zellen MTBP, CDK8 und andere Faktoren mittels RNAi, spezifischen Proteinmutanten und chemischer Inhibition zu manipulieren, um Replikationsfunktionen zu erforschen. Replikation wird im Detail analysiert durch: 1) Messung der Replikationseffizienz mittels Standardmethoden. 2) Messung der Dynamik, des Timings und Struktur der zellulären Replikation mittels verschiedener spezifischer Methoden. Rekombinante Proteine und Massenspektrometrie werden der Identifikation von Kinasesubstraten dienen.Das vorgeschlagene Projekt verspricht wichtige Erkenntnisse, wie Metazoenzellen korrekte Origin-Firingregulation in normalen und DNA Schadensbedingungen gewährleisten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen