Dynamik und Einflussfaktoren der RNA Polymerase I Transktiptionsinitiation

• Antragsteller: David Dulin, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 448328357

Proteinbiosynthese ist eine der Grundlagen für die Funktionalität und das Überleben aller Zellen. Das Produktionslevel von Proteinen korreliert mit der Anzahl an funktionsfähigen Ribosomen, den zellulären Proteinproduktionsstellen. Deshalb verwenden Zellen in der Wachstumsphase viel Energie für die Herstellung neuer Ribosomen. Aufgrund dieses Energieverbrauchs ist es für die Zellen wichtig eine Balance zwischen Biosynthese von Ribosomen und der für die Funktionsfähigkeit der Zellen benötigte Anzahl an diesen zu finden. In eukaryotischen Zellen ist die Synthese der Vorläufer der ribosomalen RNA (rRNA), die 60% der RNA in der Zelle ausmacht, durch die RNA Polymerase I (Pol I) der limitierende Schritt in der Ribosomenbiosynthese. Die Aktivität von Pol I wird streng durch die Signalwege reguliert, die das Zellwachstum kontrollieren. In vielen Krebsarten geht diese regulatorische Balance verloren. Dies führt zu einer Hyperaktivität von Pol I, und damit auch zu höheren Proteinproduktionsleveln in der entarteten Zelle. Genau diese Abhängigkeit der schnell wachsenden Krebszellen von der außerordentlich hohen Aktivität von Pol I bedeutet, dass spezifische Pol I Inhibitoren zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden könnten. Die Entwicklung von neuen Pol I Inhibitoren setzt jedoch ein genaues Verständnis der Pol I Transkriptionsdynamik, insbesondere während der stark regulierten Phase der Initiation, voraus. Da der Initiationsmechanismus von Pol I mehrere, reversible Schritte mit unterschiedlichen Molekülkonformationen erfordert, sind die Dynamik und Einflussfaktoren der Pol I Transkriptionsinitiation zum größten Teil unbekannt. Klassische, biochemische Ansätze können nur das durschnittliche Verhalten einer heterogenen Probe wiedergeben, während Strukturmethoden nur statische Bilder liefern können, ohne Zugang zur Kinetik.Dashalb schlage ich vor, biophysikalische Einzelmolekülmethoden zu nutzen, die durch das Untersuchen einzelner Pol I Trajektorien sowohl die Heterogenität als auch die Komplexität des mehrstufigen Mechanismus entschlüsseln können.Genauer gesagt werde ich Magnetic Tweezers verwenden um in Echtzeit den Zeitablauf räumlichen Ausdehnung von Biegung und Öffnung des Promotors zu beobachten, um die Dynamik der Pol I Transkriptionsinitiantion besser zu verstehen. Des Weiteren werde ich die Magnetic Tweezers mit Fluoreszenzspektroskopie verbinden, um gleichzeitig sowohl den Aufbau des Transkriptionsinitiationskomplexes als auch die daraus folgenden Veränderungen in der Promotorkonformation zu beobachten. Die Ergebnisse der hier vorgeschlagenen Experimente werden zusätzliche grundlegende Erkenntnisse für den molekularen Mechanismus der Pol I Transkriptionsinitiation liefern und werden genau erklären, wie Initiationsfaktoren diesen Mechanismus regulieren und somit neue Wege für die Entwicklung von Medikamenten eröffnen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Niederlande