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Projekt
Aufklärung von Zusammensetzung und Struktur der SLC26A5-Mikrodomäne in sensorischen äußeren Haarzellen
Antragsteller
Professor Dr. Dominik Oliver
Fachliche Zuordnung
Anatomie und Physiologie
Förderung
Förderung seit 2020
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 426950122
SLC26-Anionentranporter funktionieren in zellulärem Kontext, z.B durch Kolokalisation und direkte Bindung an funktionell gekoppelte Transporter, oder durch Einbindung in spezialisierte Membrandomänen. Es wurde bereits gezeigt, dass Lokalisation und funktionelle Interaktionen dynamisch reguliert werden können, um SLC26-vermittelten Transport an die veränderlichen physiologischen Anforderungen anzupassen. Solche Befunde legen nahe, dass SLC26-Transporter in supramolekulare Proteinkomplexe eingebunden sind. Die Identität und Zusammensetzung solcher Strukturen sind weitgehend unbekannt. In diesem Versuchsvorhaben wollen wir daher die Mikroumgebung von SLC26A5 (Prestin) aufklären. SLC26A5 wird selektiv in auditorischen äußeren Haarzellen exprimiert, und generiert dort elektro-mechanische Längenänderungen, die essentiell für cochleäre Verstärkung und die außerordentliche Empfindlichkeit des Ohrs sind. Trotz dieser hochspezialisierten physiologischen Aufgabe beruht die elektromechanische Funktion auf dem in der SLC26-Familie konservierten molekularen Transport-Mechanismus. SLC26A5 ist mit einem submembranären Protein-Gerüst assoziiert, welches die mechanischen Eigenschaften der Zelle entscheidend bestimmt. Seine Komponenten und sein molekularer Aufbau sind nicht bekannt. Über die unmittelbare Relevanz für die sensorische Physiologie und Pathophysiologie hinaus, kann dieses subzelluläre Struktur ein experimentell zugängliches Modellsystem für die supramolekulare Organisation epithelialer SLC26-Transporter darstellen. Um die Protein-Komponenten des submembranären Gerüstes zu identifizieren, werden wir Proteomik-Methoden einsetzen, die speziell die räumliche Nähe zum membranständigen SL26A5 ausnutzen. Wir werden einerseits ‚cross-linking‘-Massenspektrometrie einsetzen, um unmittelbar SLC26A5-assoziierte Proteine zu isolieren, sowie andererseits ‚proximity-dependent biotinylation‘-Methoden anwenden, um Proteine aufzureinigen, die sich in der Mikroumgebung von SLC26A5 befinden. Die zelluläre supramolekulare Organisation identifizierter Proteine werden wir anschließend mittels ‚Superresolution‘-Fluoreszenzmikroskopie und Kryo-Elektronen-Tomografie untersuchen. Um Funktionen und Interaktionen dieser Proteine und ihren Einfluss auf SLC26A5 zu untersuchen, werden die mutmaßlichen Proteinkomplexe durch heterologe Expression im Zellkultur-System rekonstituiert. Ihre Bedeutung für die Struktur und Physiologie der äußeren Haarzellen wird schließlich in knock-out Mausmodellen, durch pharmakologische Werkzeuge und mithilfe organotypischer Modellsysteme analysiert. Insgesamt erwarten wir, mit diesem Versuchsvorhaben das erste integrative Porträt der molekularen Umgebung eines SLC26-Transporters zu ermitteln.
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
