Hochauslösendes Mikroskop für Multiparameter Fluoreszenz Image Spektroskopie

• Fachliche Zuordnung: Physikalische Chemie
• Förderung: Förderung in 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 441836987

Fluoreszenzspektroskopie und Bildgebung sind wichtige biophysikalische Techniken, um die Struktur und Dynamik fluoreszenzmarkierter Biomoleküle zu untersuchen und diese unter In-vitro-Bedingungen oder in lebenden Zellen mit ihrer Funktion zu verbinden. Zu diesem Zweck nutzen wir die einzigartigen Fähigkeiten der kürzlich entwickelten fluoreszenzbasierten Spektroskopie und Bildgebungstechniken in Kombination mit der Multiparameter-Detektion, die eine maximale Information und Selektivität bei gleichzeitiger räumlicher Auflösung bietet. Das vorgeschlagene Mikroskop besteht aus zwei eng miteinander verbundenen Modulen: (1) einer konfokalen Einheit für Laser-Scanning-Mikroskopie mit einem maximalen Zeitdynamikbereich (Pikosekunden bis Minuten) und (2) einer Einheit für interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie für super-auflösende Mikroskopie. Abstände zwischen zwei Farbstoffen im molekularen Maßstab zwischen 2 und 15 nm können durch Förster Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Messungen aufgelöst werden. Wenn die Abstände zwischen den Farbstoffen 15 nm überschreiten, ist eine hochauflösende Mikroskopie mit Einzelmolekül-Lokalisations- und Kolokalisationsanalyse am besten geeignet. Um die zeitlichen und räumlichen Lücken in der Fluoreszenzspektroskopie und Bildgebung zu schließen, wollen wir eine multimodale Mikroskopie an derselben Probe durchführen, indem wir eine nahtlose Implementierung einer Kombination aus FRET-Spektroskopie und hochauflösender Mikroskopie realisieren. Auf diese Weise erzielen wir eine molekulare Auflösung und kartieren strukturelle und dynamische Merkmale der biomolekularen Anordnungen über einen weiten Bereich von Längenskalen. Um das Maximum an Informationen aus dem Fluoreszenzsignal zu gewinnen, wollen wir mit einer simultanen FRET Messungen zwischen drei Farbstoffen mehr Freiheitsgrade in der biomolekularen Dynamik untersuchen und gleichzeitig Informationen über die Korrelation von Abstandsänderungen erhalten. In dem vorgeschlagenen Aufbau können wir einzelne immobilisierte Biomoleküle unter in-vitro-Bedingungen untersuchen und eine nahtlose hochauflösende FRET-Mikroskopie in einem zellulären Kontext durchführen. Zur Charakterisierung von Einzelmolekülreaktionen wollen wir Mikrofluidik einsetzen, um reversible Gleichgewichte zu verschieben und Reaktionen von immobilisierten Molekülen durch Zugabe von Liganden oder Bindungspartnern oder durch Variation der Reaktionsbedingungen (Puffer, Ionenstärke, pH-Wert) auszulösen. Wir werden die hochauflösende multi-modale FRET-Mikroskopie dazu einsetzen, Prozesse in biomolekularen Systemen zu untersuchen, wie zum Beispiel (1) die Beobachtung der Membrantranslokation und der Chaperon abhängigen Faltung einer Lipase, (2) die Abbildung funktioneller Moleküle der angeborenen Immunabwehr auf verschiedenen Längenskalen und (3) Charakterisierung des Signalingkomplexes und der molekularen Determinanten der Signalwege für die Apoptose in Zellen.

• DFG-Verfahren: Forschungsgroßgeräte
• Großgeräte: Hochauslösendes Mikroskop für Multiparameter Fluoreszenz Image Spektroskopie
• Gerätegruppe: 5040 Spezielle Mikroskope (außer 500-503)
• Antragstellende Institution: Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
• Leiter: Professor Dr. Claus Seidel