Live 2D polarisationsaufgelöste Bildgebung (Live2DPOLIM) - eine Bildgebungsmethode zur Untersuchung nanoskaliger Proteinaggregation und (Re-)Organisation von Makromolekülen in lebenden Zellen

• Antragstellerin: Dr. Daniela Täuber
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 439139881

Das Projekt Live2DPOLIM zielt darauf ab, die kürzlich entwickelte zweidimensionale Polarisationsfluoreszenz-Bildgebung (2D POLIM) für die biomedizinische Forschung einschließlich der Untersuchung lebender Zellen zu etablieren, insbesondere für hochaktuelle Forschungsfragen in den Bereichen Immunantwort, zielgerichtete Arzneimittelfreisetzung und Organversagen aufgrund systemischer Infektion. Eine durch Modellierung unterstützte quantitative Analyse 2D-polarisationsaufgelöster Messungen ermöglicht die Untersuchung nanoskaliger Proteinaggregation und der Reorganisation molekularer Zellstrukturen in lebenden Zellen ex vivo und in vivo, unabhängig davon, ob diese in einer bestimmten Raumrichtung angeordnet sind, was mit bereits etablierten Methoden bisher nicht möglich ist. Die Analyse nanoskaliger Strukturen basiert dabei auf der Auswertung des Förster-Resonanzenergietransfers zwischen gleichartigen Fluoreszenzmarkern (homo-FRET, emFRET). Letzteres ist eine Standardmethode für Abstandsmessungen im Bereich von 2–10 nm, einem Größenbereich, der nach wie vor für konventionelle und selbst für hochauflösende Mikroskopie nur schwer zugänglich ist. Die Kombination von Live2DPOLIM mit neuartigen markerfreien Methoden, die auf Infrarotanregung und Detektion mittels Rasterkraftmikroskopie (IR-AFM) basieren, liefert zusätzliche hochaufgelöste chemische Informationen zur nanoskaligen Anordnung von Strukturen auf Zelloberflächen. Dies ermöglicht einen ergänzenden Zugang zu molekularen Strukturänderungen auf Zellmembranen, die sich als Folge aus der biomedizinischen Behandlung der Zellen ergeben. Außerdem bietet sich dadurch eine Möglichkeit, das Ergebnis der Färbemethoden auf molekularer Ebene zu überprüfen, was wiederum die räumliche Modellierung für homo-FRET verbessert, welche für die quantitative Analyse von Live2DPOLIM verwendet wird.Die Stärke von Live2DPOLIM liegt in der Fähigkeit Nano-Aggregation von Zellstrukturen zu charakterisieren. Deren Lokalisierung wird jedoch durch die herkömmliche optische Auflösung begrenzt. Die hohen Anforderungen an eine möglichst genaue Ermittlung der Polarisationseigenschaften des untersuchten Materials erschweren eine Verbesserung der räumlichen Auflösung. Daher wird die ergänzende Implementierung eines Analysecodes für den zusätzlichen Einsatz polarisationsaufgelöster Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (Single Molecule Localization Microscopy, SMLM) vorgeschlagen, der eine räumliche Auflösung fluoreszenzmarkierter Strukturen von Zellen in vivo und ex vivo im Bereich von ca. 50 nm ermöglicht und dadurch die Erkenntnisse über die Nanoaggregation aus Live2DPOLIM und die hochaufgelöste chemische Information durch IR-AFM ergänzt. Diese Kombination ermöglicht eine Zuordnung der mit Live2DPOLIM beobachteten Nanoaggregation zu bestimmten zellulären Strukturmerkmalen in den Bildern aus der hochauflösenden SMLM, wodurch das Verständnis von infektionsbedingter Schädigung und entsprechenden Therapien weiter vertieft wird.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen