Untersuchungen zur Pathogenese von REEP1- und REEP2-assoziierten Axonopathien

• Antragsteller: Professor Dr. Christian Andreas Hübner
• Fachliche Zuordnung: Molekulare und zelluläre Neurologie und Neuropathologie ; Humangenetik
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 431954759

Viele mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziierte Gene, die sich primär an Axonen manifestieren, kodieren für Proteine des endoplasmatischen Retikulums (ER) mit Membran-krümmenden Eigenschaften. Dies gilt auch für REEP1 und REEP2, die zwei Retikulon-Homologiedomänen (RHD) gefolgt von einer amphipathischen Helix aufweisen. Während REEP2-Varianten nur mit autosomal-dominant vererbter spastischer Paraplegie (HSP) in Verbindung gebracht werden, verursachen bestimmte REEP1-Varianten HSP, während andere Varianten zu einer hereditären motorischen Neuropathie (HMN) führen. Um herauszufinden, warum einige REEP1-Mutationen mit HSP und andere mit HMN assoziiert sind, haben wir ein Mausmodell mit einer Deletion von Exon 5 generiert, da die HMN-assoziierten REEP1-Variante c.304-2A>G zum Ausspleißen von Exon 5 führt, ohne dass das Leseraster verschoben wird. Die resultierenden Knockin-Mäuse wurden anschließend in der ersten Förderperiode im Vergleich zu Reep1-Knockout-Mäusen analysiert. Unsere Untersuchungen zeigen, dass homozygote Knockin-Mäuse eine HMN mit Degeneration peripherer motorischer Fasern entwickeln. Wir können außerdem zeigen, dass REEP1 proteasomal abgebaut wird und HMN-assoziierte Varianten im Vergleich zum Wildtyp-Protein nicht oder weniger ubiquitiniert sind. Die gestörte Ubiquitinierung führt zur Akkumulation des varianten Proteins in Lysaten von peripheren Nervenfasern von Knock-in-Mäusen im Vergleich zum WT-Protein in Kontrollen. Zusammen mit verstärkten Membran-krümmenden Eigenschaften könnte dies die Ursache für einen toxischen Funktionsgewinn sein. Damit übereinstimmend ist das ER in Motoneuronen des Rückenmarks von Knockin-Mäusen fragmentiert. Während der beantragten zweiten Förderperiode wollen wir unsere Experimente abschließen. Wir werden untersuchen, ob HUWE1, eine E3 Ligase, die wir im Interaktom von REEP1 gefunden haben, Reep1 ubiquitiniert. Falls ja, werden wir In-vitro-Ubiquitinierungstests mit HUWE1 durchführen und klären, ob die Ubiquitinierung die Membran-krümmenden Eigenschaften von Reep1 beeinflusst, was wir kürzlich für zwei verwandte Proteine zeigen konnten. Aufgrund zweier aktueller Berichte, dass das Hefe-Ortholog Rop1 von Reep1 und Reep2 für die Bildung des Phagophors erforderlich ist, werden wir außerdem untersuchen, ob der Verlust von Reep1 oder Reep2 zu einem Autophagiedefekt führt. Darüber hinaus werden wir analysieren, ob die Unfolded Protein Response (UPR), der sekretorische Weg, Glykosylierung und Calciumhomöostase von einem Funktionsverlust oder -gewinn von Reep1 abhängig sind. Um die Folgen des Funktionsverlusts oder -gewinns von Reep1 für das axonale ER direkt zu visualisieren, werden wir Mäuse mit Expression des HaloTag im ER-Lumen erzeugen und diese mit Reep1 KO und KI Mäusen kreuzen. Auf diese Weise können wir das ER in Geweben von Reep1 KO- und KI-Mäusen mit dSTORM rekonstruieren. Schließlich werden wir mit der Analyse der Reep2 Knockout und Reep1/Reep2 Doppel-Knockout-Mäuse fortfahren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen