Funktionsanalyse der chloroplastidären Eisen-Schwefel J-Domänen Proteine CDJ3-5

• Antragsteller: Professor Dr. Michael Schroda
• Fachliche Zuordnung: Biochemie und Biophysik der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 427947477

Hsp70-Chaperonsysteme sind hochkonserviert und existieren im Cytosol, dem ER, Mitochondrien und Chloroplasten eukaryotischer Zellen. Das plastidäre Hsp70-System leitet sich von dem aus Bakterien ab und besteht aus Hsp70, einem Nukleotidaustauschfaktor vom GrpE-Typ sowie sogenannten J-Domänen-Proteinen. Letztere binden ausgewählte Substratproteine und geben diese zur Prozessierung an Hsp70 weiter. CDJ3-5 heißen drei der sechs J-Domänen-Proteine im Chloroplasten der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Sie besitzen neben der J-Domäne und einer Domäne unbekannter Funktion auch eine bakterielle Ferredoxindomäne. Für CDJ3 und 4 konnten wir zeigen, dass hier ein Redox-aktiver 4Fe-4S-Cluster vorliegt. Vertreter von CDJ3-5 finden sich in den Chloroplasten aller Viridiplantae (Pflanzen und Algen) sowie in den Thaumarchaeota, die einen solchen über horizontalen Gentransfer erworben haben. Wir konnten zeigen, dass CDJ3 und 4 ATP-abhängig mit plastidärem HSP70 interagieren und dessen ATPase-Aktivität stimulieren, jedoch nicht die Faltung denaturierter Proteine unterstützen. Sie spielen also offenbar keine Rolle bei der Proteinhomöostase. Über CDJ3 wissen wir, dass seine Expression durch Licht induziert wird und es einen Komplex mit RNA bildet. Alle drei Proteine sind sehr schwach exprimiert. Ansonsten ist über die Funktionen von CDJ3-5 nichts bekannt. Ziel dieses Projektes ist, diese Funktionen im Modellsystem Chlamydomonas reinhardtii aufzuklären. Dazu wollen wir mit Hilfe eines neuen Bausatzes für Synthetische Biologie in Chlamydomonas Konstrukte zur Überexpression der Wildtyp-Form von CDJ3-5 sowie von mutierten Formen herstellen. In letzteren wird das konservierte HPD-Motif in der J-Domäne zu AAA mutiert, womit dominant negative Effekte erzeugt werden sollen. Außerdem kodieren diese Konstrukte für Erweiterungen an den C-Termini. Diese sollen dazu dienen i) stabil interagierende Proteine mittels Affinitätsreinigung und LC-MS/MS zu identifizieren; ii) transient interagierende Proteine mittels proximity labeling zu identifizieren; iii) die komplexierte RNA-Spezies zu identifizieren, auch mit Hilfe von RIP-Chip und CLIP; iv) die suborganelläre Lokalisierung zu bestimmen. Weiterhin wollen wir mittels CRISPR/Cpf1 Mutanten in den CDJ3-5 Genen generieren und diese gemeinsam mit vorhandenen cdj3/4 Mutanten und den Überexpressionsstämmen phänotypisch charakterisieren. Hierfür soll zunächst die Überlebensrate unter diversen Stressbedingungen getestet werden. Weiterhin wollen wir auf dem 15N-Isotop basierte, quantitative Proteomanalysen durchführen, um im Vergleich zum Wildtyp differenziell exprimierte Proteine zu identifizieren. Zuletzt möchten wir den Fe-S-Cluster von CDJ5 mittels Mösbauer-Spektroskopie untersuchen um herauszufinden, ob sich dieser Cluster von denen der phylogenetisch weiter entfernten CDJ3/4-Proteine unterscheidet.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1927: Iron-Sulfur for Life