Biochemische und strukturbiologische Analyse der Regulation des humanen Transkriptionselongationsfaktors P-TEFb

• Antragsteller: Professor Dr. Matthias Geyer
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2007 bis 2011
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 42267534

Die Regulation der Transkription in Eukaryoten durch die RNA Polymerase II (RNAPII) vollzieht sich in einem komplexen Wechselspiel zahlreicher Transkriptionsfaktoren, die den Übergang von der Initiation zur produktiven Elongation und Termination steuern. Nach der Initiation pausiert die RNAPII etwa 50-150 Nukleotide hinter der Startstelle. Der positive Transkriptionselongationsfaktor P-TEFb setzt die RNAPII wieder frei, indem die C-terminale Domäne (CTD) der RNAPII phosphoryliert wird. Die aktive Form von P-TEFb besteht aus der Kinase Cdk9 und dem korrespondierenden Cyclin T. Eine Überaktivität der Transkriptionselongation löst Krebserkrankungen wie Brust- oder Darmkrebs und die Leukämie-Erkrankung mixed-lineage-leukemia (MLL) aus, aber auch myokardiale Hypertrophie und HIV-Infektion gehen auf eine Fehlfunktion dieser molekularen Schnittstelle zurück. Wir möchten in dem hier beantragten Forschungsvorhaben verstehen, wie dieser Transkriptions-steuernde Faktor auf molekularer Ebene aktiviert und reguliert wird. In Vorarbeiten konnten wir zeigen, dass die C-terminale Domäne des humanen Brd4 Proteins P-TEFb aus dem inhibierten Zustand aktiviert und die Kinaseaktivität durch Brd4 sogar über den basalen Zustand stimuliert wird. Wir möchten nun die Substratspezifität für den P-TEFb/Brd4 Komplex ermitteln und den molekularen Mechanismus der Aktivierung untersuchen. Brd4 weist zudem eine sequenzielle Ähnlichkeit mit dem viralen HIV-1 Tat Protein auf, die in Mutationsstudien analysiert werden soll. Die Inhibierung von P-TEFb verfolgt über den zellulären 7SK snRNP Komplex, der sich aus 7SK snRNA, Larp7, dem Inhibitionsfaktor Hexim1 und P-TEFb zusammensetzt. Vor kurzem wurde das spliceosomale Protein SRSF2 als weiterer Interaktionspartner für den 7SK Ribonukleoproteinkomplex beschrieben, der für die Rekrutierung und Aktivierung an transkribierte Gene zuständig ist. Wir beabsichtigen diesen hexameren 7SK snRNP Komplex aus rekombianter Proteinexpression für die funktionelle Charakterisierung aufzubauen. Schließlich soll das CdkF1/CycH Kinasepaar in baculo-infizierten Insektenzellen exprimiert und die Fähigkeit Ser7 Positionen der CTD zu phosphorylieren mit analytischen Methoden analysiert werden. Dieses Phosphorylierungssignal geht mit der Transkriptionsinitiation einher und stimuliert die Erkennung und Aktivität von P-TEFb. Wir hoffen durch diese Arbeiten Einblicke in die Regulation und Substratbindung von P-TEFb auf molekularer Ebene zu erhalten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen