Regulation der stochastischen Genexpression in einzelnen Zellen durch die dynamische p53 Antwort auf genotoxischen Stress

• Antragsteller: Professor Dr. Alexander Loewer
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Bioinformatik und Theoretische Biologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 421980029

Der Tumorsuppressor p53 schützt menschliche Zellen vor Transformation und verhindert so die Krebsentstehung. Er wird durch genotoxischen Stress aktiviert und vermittelt die zelluläre Antwort durch transkriptionelle Regulation hunderter Zielgene. Durch quantitative zeit-aufgelöste Fluoreszenzmikroskopie konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Arten von DNA Schäden zu spezifischen dynamischen Mustern der p53-Akkumulation im Zellkern führen, die von regelmäßigen Pulsen bis zu monoton Anstiegen reichten. Weitere Studien ergaben, dass die Dynamik der p53-Akkumulation wesentlich zur Regulation der Zielgenexpression beiträgt und dadurch entscheidet, ob Zellen Schäden reparieren und sich weiter teilen oder terminale Zellschicksale wie Seneszenz oder Apoptose auslösen. Die molekularen Mechanismen, die eine spezifische Regulation der Genexpression durch zeitliche Veränderungen der p53 – Konzentration erlauben, sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Da Genexpression ein inhärent stochastischer Prozess mit zufälligen Übergängen von inaktiven und aktiven Phasen ist, sollten solche mechanistischen Fragen mit Einzelmolekülauflösung auf der Ebene von einzelnen Zellen untersucht werden.Mit dem vorgeschlagenen Forschungsvorhaben möchten wir die Eigenschaften der Zielgen-Promotoren bestimmen, die von p53 nach genotoxischem Stress moduliert werden, und dabei vor allem den Einfluss von dynamischen Änderungen der p53 – Menge erfassen. Dazu werden wir „single-molecule fluorescence in-situ hybridization“ (smFISH) in Kombination mit mathematischer Modellierung verwenden, um stochastische Parameter der Promotoraktivität von Zielgenen zu ausgewählten Zeitpunkten nach Induktion verschiedener DNA-Schäden zu messen. Um Promotoraktivität in lebenden Zellen zu untersuchen, werden wir mittels MS2-System und Cas9-vermittelter Genomeditierung endogene RNA selektierter Zielgene markieren. Wir werden dann die Dynamik der p53-Akkumulation systematisch durch genetische und pharmakologische Perturbation verändern und die daraus resultierenden Veränderungen in der Promotoraktivität über die Zeit durch Lebendzellmikroskopie verfolgen. Schließlich werden wir die Bindung von p53 sowie epigenetische Modifikationen an Zielgenpromotoren nach genotoxischen Stress zeitaufgelöst bestimmen und durch gezielte Perturbationen Rückschlüsse auf die zugrunde liegenden Mechanismen ziehen. Zusammengenommen wird das vorgeschlagene Forschungsvorhaben zu einem umfassenden Verständnis des Informationsfluss von genotoxischem Stress zu p53-Dynamiken, Zielgenexpression und Zellschicksal führen. Dadurch können wir neue Erkenntnisse über die veränderte Funktion von p53 während onkogener Transformationen gewinnen und möglicherweise neue Strategien zur Reaktivierung des Tumorsuppressors in Krebszellen entwickeln.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen