Molekulare Mechanismen am Scheideweg zwischen DNA Replikation und Schwesterchromatid-Kohäsion

• Antragsteller: Dr. Daniel Grabarczyk
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 417702356

In eukaryotischen Organismen ist die DNA-Replikation ein stringent regulierter Prozess. Die Replikationsgabel muss auf DNA-Schäden und -Blöcke reagieren, ist an der Signaltransduktion beteiligt, und muss epigenetische Informationen sowie den strukturellen Aufbau der DNA übertragen. Defekte in diesen Prozessen führen zu Replikationstress and Genominstabilität, die beide zur Entstehung von Krebs beitragen. Trotz ihrer fundamental physiologischen und pathologischen Bedeutung, sind diese Prozesse nur unvollständig charakterisiert. Besonders unklar ist, wie die zwei neuen Chromatide an der Replikationsgabel verbunden werden. Dieser Prozess ist kritisch, damit die Chromatide während der Mitose auf die beiden Tochterzellen verteilt werden können. Um die Etablierung der Kohäsion zu verstehen, werden wir die drei entscheidenden Replikations- und Kohäsion-verknüpfte Proteine, Chl1, Ctf18-RFC und Tof1-Csm3, untersuchen. Diese Faktoren spielen eine wichtige Rolle in der Entstehung des Melanoms und des kolorektalen Carcinoms. Mutationen im Chl1 Gen führen außerdem zu der Entwicklungsstörung “Warsaw Breakage Syndrome”. Des Weiteren wird das Chl1-Protein auch vom humanen Papillomavirus missbraucht. Ctf18-RFC ist ein alternativer Klemmenprotein-Lader, der aus einem einzigen Modul bestehend aus Ctf8, Dcc1 und dem C-terminus von Ctf18 bildet. Dieses Modul interagiert mit DNA und der DNA Polymerase ε. Um die Funktion beider Interaktionen zu verstehen, werden wir die Struktur des Ctf18-RFC Komplexes in Gegenwart von DNA und DNA Polymerase ε bestimmen. Wir werden Röntgenkristallografie der minimalen Komplexe mit Elektronenmikroskopie und ortsspezifischer Mutagenese kombinieren, um die Funktion dieser großen Komplexe zu charakterisieren. Mittels biochemischer und biophysikalischer Experimente werden wir zeigen wie sich die beiden Komplexe untereinander und die Polymerase- und Klemmenprotein-Lader-Aktivität jedes Proteins regulieren. Ctf18-RFC interagiert sehr wahrscheinlich mit Chl1, einer zur XPD Familie gehörenden DNA Helikase. Diese Protein besitzt strukturelle Helikase Spezifität aber bisher sind keine physiologischen Substrate bekannt. Um die Rolle des Chl1 Proteins in der Kohäsion zu analysieren, werden wir die Interaktion zwischen Ctf18-RFC und Chl1 validieren und kartieren. Um einen Einblick in zelluläre Substrate zu erhalten, werden wir ein Substratspezifitätsprofil des Enzyms erstellen. Des Weiteren werden wir die Mutationen charakterisieren , die das Profil beeinflussen. Unsere Analyse werden zeigen, wie sowohl Ctf18-RFC als auch Chl1 die Chromatid-Kohäsion an der DNA-Replikationsgabel etabliert. Dies wird auch dazu führen pathologische Situationen zu verstehen und Ansatzpunkte für neue Therapeutika zu entwickeln.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen