Multiple Verknüpfungen mittels Sortase-vermittelter Ligation am Beispiel von Protein-Polymer-Konjugaten

• Antragsteller: Dr. Ulrich Glebe
• Fachliche Zuordnung: Polymermaterialien
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 414977640

Sortasen sind Enzyme, die in der Zellwand von Gram-positiven Bakterien vorkommen und Oberflächenproteine kovalent an die Zellwand binden. Sortase A knüpft eine Peptidbindung zwischen dem Peptidmotiv LPXTG und einem Oligoglycin. Diese unter den Begriffen Sortase-vermittelte Ligation (Engl. sortase-mediated ligation, SML) und sortagging bekannte Ligationstechnik und hat sich zu einem vielfältig angewendeten Ligationswerkzeug in der Grundlagenforschung entwickelt. Mithilfe von Sortase A lässt sich ein Protein mit einem anderen Biomolekül, einem kleinen synthetischen Molekül, einem Polymer oder einer Oberfläche verbinden. Dabei müssen die Substrate lediglich mit einer C-terminalen LPXTG und einer N-Terminalen Gx Sequenz versehen werden. Eine Schwäche der Sortase-Katalyse besteht darin, dass eine gebildete Bindung (LPXTGGG) wieder ein Substrat für das Enzym darstellt. Die Reaktion ist reversibel und folglich kann eine gebildete Bindung auch wieder von dem Enzym gespalten werden. Während mehrere Möglichkeiten der Gleichgewichtsverschiebung heutzutage eine Ligation mit nahezu quantitativer Umsetzung ermöglichen, ist es nach wie vor nur durch anspruchsvolle Strategien möglich oder gar noch nicht gezeigt, mehrere Bindungen nacheinander durch eine Sortase zu knüpfen. Ketten aus Proteinen, mehrere Lagen an Proteinen auf Oberflächen und zweifach an C- und N-Terminus modifizierte Proteine sind daher noch schwer zugänglich. Im Rahmen dieses Vorhabens soll eine effiziente Vorgehensweise entwickelt werden, die die Verknüpfung mehrerer Bausteine mittels Sortase A gestattet. Dies soll am Beispiel der Substanzklasse der Protein-Polymer-Konjugate entwickelt werden und einen bisher kaum zugänglichen Typ an Protein-Konjugaten mit zwei verschiedenen Polymerketten erschließen. Außerdem sollen Protein-Oligomere in einer zu der Merrifield Peptidsynthese analogen Vorgehensweise hergestellt werden.Das Vorhaben umfasst die Synthese von Polymer-Bausteinen für die Anbindung an sowohl C- als auch N-Terminus eines Proteins. Darauf aufbauend sollen Protein-Polymer-Konjugate durch SML synthetisiert werden. Aufeinanderfolgende Ligationen mit Sortase A, bei denen die gebildeten Bindungen nicht mehr durch das Enzym gespalten werden, wurden bisher nicht gezeigt. Dies soll durch den Einsatz von β-Hairpin-Strukturen bildende Aminosäuresequenzen erreicht werden, welche kein Substrat für Sortase A mehr sind. Dieser Ansatz soll zunächst exemplarisch durch die multiple (aber unkontrollierte) Verknüpfung eines Proteins gezeigt werden. Um eine kontrollierte Verknüpfung von drei oder mehreren verschiedenen Bausteinen zu gewährleisten, muss ein Protein-Terminus zunächst blockiert werden. Diese Vorgehensweise soll mithilfe von maskierten Oligoglycinen entwickelt und durch die Verknüpfung mehrerer Proteine demonstriert werden. Anschließend soll die Strategie auf die Anbindung zweier Polymerketten an ein Protein übertragen werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen