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Projekt
SP4: Zentrosomenintegrität als Determinante von Replikationsstress und mitotischer Dysfunktion
Antragsteller
Professor Dr. Matthias Dobbelstein
Fachliche Zuordnung
Zellbiologie
Förderung
Förderung von 2018 bis 2023
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 395736209
Zentrosomen sind essenziell für die Zusammensetzung der mitotischen Spindel und für die exakte Trennung der Chromosomen während der Mitose. Wie Chromosomen müssen auch Zentrosomen genau einmal während des Zellzyklus verdoppelt werden, was durch gegenseitige Regulation bedingt sein könnte. Klinisch führen Keimbahnmutationen zentrosomaler Komponenten zu einem ähnlichen Krankheitsbild wie Defekte bei Replikationsstress-Signalwegen, nämlich dem Seckel-Syndrom. Unser Ziel ist es, zu verstehen, wie zentrosomale Integrität die DNA-Replikation beeinflusst. Vorarbeiten zeigen, dass die Zerstörung zentrosomaler Strukturen, durch Inhibition der polo-like kinase 4 (PLK4) oder durch Depletion zentrosomaler Komponenten, die Progression von DNA-Replikationsgabeln behindert. Dies wurde durch sog. DNA Fiber Assays festgestellt, durch die die Inkorporierung von Nukleotiden in einzelne Replikationsgabeln gemessen wird. Um sicherzustellen, dass die Verlangsamung der Replikation nicht eine Konsequenz aberranter Mitose war, führten wir diese Experimente in Zellen durch, die zunächst durch CDK4-Inhibition im Zellzyklus angehalten wurden, bevor wir zentrosomale Elemente depletierten. Erst dann wurden die Zellen in die S-Phase entlassen, um die DNA-Replikation zu messen. Verminderte Progression der Replikationsgabeln wurde mindestens teilweise durhc die Aktivierung der Kinase MK2 alias MAPKAPK2 vermittelt. Darüber hinaus beobachteten wir die Abhängigkeit der DNA-Replikation von zentrosomaler Integrität überwiegend in Zellen mit Ras-Aktivierung. Wir schließen daraus, dass die Zerstoörung zentrosomaler Sttrukturen MK2 aktiviert und die Progression von DNA-Replikationsgabeln behindert. Wir planen nun, die dem zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären, einschließlich ihrer Beziehung zur Mitose. Dazu gehört die Identifizierung der Signalwege, die durch Zentrosom-Zerstörung aktiviert werden, und die die DNA-Replikation behindern. Phosphorylierte Signalintermediate werden dazu quantifiziert, in Kooperation mit Petra Beli (SP1). Wir werden dies nicht nur in Standardzelllinien messen, sondern auch in Fibroblasten von Seckel-Syndrom-Patienten, aus SP6 Wollnik. Zusätzlich werden wir in Kooperation mit Holger Bastians (SP2) untersuchen, ob dieser Replikationsstress nach Zentrosomenzerstörung auch zur Abnormalität von Spindeln führt, und zur Chromosomen-Fehlsegregation in der darauffolgenden Mitose. Des Weiteren werden wir detaillierte Analysen der strukturellen und numerischen Chromosomenaberrationen durchführen, in Antwort auf Zentrosomenzerstörung (Zusammenarbeit mit SP-Z). Schließlich werden wir der Frage nachgehen, ob zentrosomale Abnormalitäten auch die Charakteristika der DNA-Replikation während der Mitose beeinflussen.
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
