Etablierung neuer zellfreier Markierungsstrategien für die NMR basierte Untersuchung von Membranproteinen

• Antragsteller: Dr. Frank Bernhard
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 404640060

Ziel des Antrages ist die Entwicklung von hoch-produktiven zellfreien Lysaten für die hintergrundfreie Markierung von Proteinen durch Eliminierung von Enzymen kombiniert mit neunen Markierungsschemen basierend auf Aminosäurevorstufen. Die Technologie wird dann für die NMR basierte Charakterisierung schwieriger Proteine wie GPCRs und ABC Transporter verwendet werden. Zellfreie Expression ist eine schnelle und verlässliche Methode zur Produktion von Membranproteinen. Allerdings stellen "isotopic scrambling" und die Re-Protonierung von deuterierten Positionen noch immer ein Hindernis für die spezifische Markierung für NMR Studien dar. Inhibitoren, chemische Behandlung oder Deuterierung des gesamten Lysates sind keine befriedigenden Lösungen, da sie die Proteinausbeute z.T. erheblich beeinträchtigen. Wir wollen daher Lysate generieren, die für die Stabilisierung von Aminosäuren und Unterdrückung von „isotopic scrambling“ optimiert sind. Basierend auf unserer Proteom-Analyse von Lysaten haben wir kürzlich Enzyme identifiziert, die für diese Probleme verantwortlich sind. Genetische "Knock-out" Varianten sowie Enzyme, die zur effizienten Eliminierung aus dem Lysat sollen mittels „tags“ modifiziert sind, werden getestet werden. Die neuen Lysate werden dann sowohl mit löslichen als auch mit Membranproteinen verwendet werden. Desweiteren werden wir neue Protokolle zur spezifischen 13C/2H Markierung von Seitenkettenpositionen von Aminosäuren etablieren, vor allem für die Methylgruppen von Leu, Val und Ile. Noch vorhandene metabolische Enzymketten werden auf ihre Funktionalität in den Lysaten getestet und wenn nötig mit extern exprimierten Enzymen vervollständigt werden. Ausgangspunkt für die Markierungsstrategien werden Vorstufen der Aminosäuren sein. Das geringe Volumen von zellfreien Reaktionen stellt einen enormen Vorteil für die effiziente und kostengünstige Nutzung der Methode zur spezifischen Markierung von Proteinen dar. Als eine erste Realisierung haben wir die effiziente Methylgruppen-Markierung ausschließlich von Valinen in Proteinen bereits etabliert, was bisher in konventionellen zell-basierten Systemen nicht möglich war. Die neuen Protokolle werden für die spezifische Markierung von schwierigen Proteinen wie der TMD0 Domäne des ABC Transporters TapL und des β1-adrenergen Rezeptors getestet werden. Effiziente zellfreie Expressionsprotokolle für beide Membranproteinen sind bereits etabliert und die neuen Methoden werden es erlauben, die Qualität und Auflösung von NMR Spektren zu erhöhen und so strukturelle Untersuchungen und Bindungsstudien ermöglichen. Dieses Projekt wird die Anwendung von zellfreier Expression ausdehnen und vor allem Markierungsmöglichkeiten für die NMR basierte Untersuchung von Strukturen, Dynamik und Wechselwirkungen auch von schwierigen Proteinen wie Membranproteinen erweitern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich: Professor Dr. Volker Dötsch