Cis- und trans-wirksame Regulatoren für Stabilität, Struktur und Translation von mRNAs (als Fortsetzung)

• Antragsteller: Dr. Andreas Schlundt
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie ; Biophysik
• Förderung: Förderung seit 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 404540462

Posttranskriptionelle Regulation steuert die Genexpression z. B. in Entwicklung und Immunantwort. mRNAs enthalten strukturierte und unstrukturierte cis-Elemente in ihren 3'-untranslatierten Regionen (UTR), die von trans-agierenden RNA-bindenden Proteinen (RBPs) mit entsprechenden Domänen (RBDs) erkannt werden, und so das Schicksal der mRNA vermitteln. Die Rolle von RNA-Sequenz, -Struktur und -Modifikation in regulatorischen Protein-mRNA-Komplexen (mRNPs) ist ebenso wie die 3D-Anordnung von mRNPs oft unbekannt, sei es in voller Komplexität oder relevanten Details. In unserer diesem Antrag vorausgehenden Arbeit haben wir mRNPs untersucht, die entweder aus mehreren linearen oder strukturierten cis-Elementen bestehen, wenn sie von den Multidomänen-RBPs IMP3 und Roquin gebunden werden. Beide Proteine haben einen bedeutenden Einfluss auf spezifische mRNA-Regulation: Roquin bei der Immunregulierung durch die Erkennung von mRNA-Stammschleifen; IMP3, ein RBP, dass im Tumorwachstum durch maskierende Interaktion mit Clustern kurzer linearer cis-Elemente eine Rolle spielt. In Erweiterung des statischen Bildes einzelner RNA-Motiv-RBD-Interaktionen, haben wir cis-trans-Netzwerke in spezifischer mRNA-Erkennung für beide Systeme aufgeklärt. Ein Schwerpunkt lag dabei auf der Rolle sequentieller cis-Element-Cluster im Vergleich zu ihrer 3D-Anordnung für mRNPs, sowie in resultierenden allgemeinen Konzepten für mRNA-Erkennung. Diese Arbeit und Erkenntnisse aus anderen Labors haben daran anknüpfende sowie neue Fragen aufgeworfen, z.B. die Rolle von RNP-Stöchiometrie, vermittelt durch Protein-Protein (PPI)- und RNA-RNA-Wechselwirkungen, sowie insbesondere von durch m6A-Methylierung beeinflusster RNA-Struktur für Komplexbildung. In Fortführung der Arbeiten wird dieser Antrag beide Proteine und ihre Ziel-RNAs hinsichtlich dieser Fragen behandeln. Auf der Grundlage gewonnener Erkenntnisse über die Komplexbildung von Roquin mit dem 3'UTR des T-Zell-Korezeptors Ox40 werden wir mittels Kristallographie und Cryo-EM hochauflösende Strukturen mit mehreren strukturierten cis-Elementen bestimmen. Außerdem werden wir die Rolle von Roquin- und RNA-Oligomeren für die RNP-Bildung über NMR und native Massenspektrometrie (MS) untersuchen. Beides zusammen soll dazu beitragen, eine hochauflösende Struktur des Roquin-N-Terminus mit einem kombinierten Ziel-RNA-Motiv durch integrierte Strukturbiologie zu erhalten. In der Erkennung multipler RNA-Einzelstrang-Elemente in Onkogen-mRNAs durch IMP3 werden wir uns mittels RNP-Biochemie und SAXS auf die Rolle von KH3-4-vermittelten PPI für RNA-Affinität und -Spezifität konzentrieren. Dies wird mit der Arbeit an erweiterten IMP3 RBD-RBD- und RBD-RNA-Interfaces im Volle-Länge-Kontext unter Verwendung von Massenspektrometrie einhergehen. Ein Projektteil wird auf der Grundlage von NMR und biochemischen Ansätzen speziell die selektive m6A-RNA-Erkennung durch Tandem-RBDs von IMP3 im Vergleich zum gut untersuchten m6A-Binder IMP1 untersuchen.

• DFG-Verfahren: Emmy Noether-Nachwuchsgruppen