Preclinical investigations with inhibitors of DNA double-strand break repair for improved chemotherapy of malignant brain tumours
Final Report Abstract
Glioblastoma multiforme (WHO Astrozytom Grad III und IV) ist ein sehr aggressiver Hirntumor mit schlechter Prognose und schwachem Ansprechverhalten auf Standardtherapien. Daher sind neue chemotherapeutische Ansätze erforderlich. Ein Hauptpunkt unserer Projektarbeiten war die Analyse des Verlustes des Tumorsuppressors PTEN auf zelluläre Vorgänge wie die DNA-Replikation, Transkription oder die Gentoxizität der Glioblastomzellen. Unsere Charakterisierung der hergestellten, isogenen PTEN-Knockout (PTENko) Zellen zeigte eine leicht beschleunigte Proliferation in Verbindung mit deutlichen Veränderungen in der DNA-Replikation (in DNA-Fiber- Assays). Die Geschwindigkeit der DNA-Replikation in PTENko Zellen war leicht reduziert und assoziiert mit einer Zunahme geblockter DNA-Replikationsgabeln sowie der Entstehung neuer Replikationsursprünge. Die spontane Frequenz der Chromosomaberrationen und Schwesterchromatid-Austausche waren signifikant erhöht, was auf eine genetische Instabilität nach PTEN-Verlust hindeutet. Eine Rekonstitution der PTEN Expression in den PTENko Zellen mittels GFP-PTEN-Fusionsproteins führte zur Korrektur sämtlicher PTENko Defekte in den PTEN- GFP Zellen. Beim Vergleich der PTENko- mit den PTEN-GFP-Zellen in der iPOND-Methode beobachteten wir an der DNA-Replikationsgabel eine erhöhte Akkumulation heterogener RNA-bindender Proteine (hnRNPs), die an der Aufrechterhaltung der Genomintegrität und der Regulierung der Transkription beteiligt sind. Untersuchungen der globale RNA-Synthese zeigten deutlichen Unterschiede der Transkriptionsraten zwischen der PTENko- und mit PTEN-GFP "geretteten" Zellen. Aufgrund dieser Ergebnisse und der DNA-Fiber-Assay-Daten, die auf Replikationsstress und ein dereguliertes Origin-Firing in den PTENko Zellen hinweisen, erwarteten wir mehr Frontalkollisionen zwischen Transkription und DNA-Replikation und dadurch die Entstehung genomdestabilisierender R-Loops in diesen Zellen. Diese Hypothese wird zukünftig in weiterführenden Experimenten adressiert werden. Behandlung mit Temozolomid (TMZ) ist die Standard-Chemotherapie von Hirntumoren und Hirnmetastasen. TMZ induziert tödliche sekundäre DNA-Doppelstrangbrüche (DSB), die durch homologe Rekombination (HR) und die „Backup“ PARP-abhängige nicht-homologe Endverknüpfung repariert werden können. Für die Modulation der DSB-Reparatur und der Empfindlichkeit gegen TMZ haben wir spezifische HR-Inhibitoren (der RAD51-Inhibitor RI-1) und PARP-Inhibitoren (PARPi) wie Veliparib oder Pamiparib verwendet. Die Kombinationen, die In vitro eine erhöhte Effizienz aufwiesen, wurden weiter im intrakraniellen orthotopischen Mausmodell untersucht. Bei den Tieren mit LN229-Wildtyp-Implanten war eine tendenziell leicht erhöhte Überlebensrate nach Behandlung mit PARPi, RAD51i oder mit einer Kombination der beiden Hemmstoffe im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe zu erkennen. Diese Tumoren haben sich jedoch als sehr sensitiv gegenüber TMZ erwiesen, da alle TMZ-behandelten Tiere bis zum Ende des Experiments überlebten. Daher konnte ein Effekt der Kombi-Therapie mit PARPi nicht abgeschätzt werden. Die aus PTENko-Zellen abgeleiteten Tumoren erwiesen sich jedoch als schneller wachsend und resistenter gegenüber TMZ. Nach der Kombination TMZ+PARPi war die Überlebensrate im Vergleich zur TMZ-Monotherapie leicht erhöht. Dies kann als Hinweis interpretiert werden, dass Patienten mit PTEN-Verlust - was bei vielen Rezidiven der Fall ist - möglicherweise von einer TMZ+PARPi Kombination profitieren könnten.
Publications
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