Kontextspezifische Regulation der Notch Signalaktivität durch Phosphorylierung von Suppressor of Hairless in Drosophila

• Antragstellerin: Dr. Anja Christina Nagel
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsbiologie ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 400152242

Der Notch (N)-Signalweg steuert die Zelldifferenzierung höherer Metazoen und wurde u.a. mit Leukämien assoziiert. Dank der genetischen Zugänglichkeit dient uns Drosophila als Modellsystem. Hier werden N-Signale durch den Transkriptionsfaktor Su(H) übertragen. Massenspektroskopie zeigt eine in vivo Phosphorylierung von Su(H) an Serin 269, das folglich Angriffspunkt einer Regulation durch andere Signalwege sein könnte. Es wurden phospho-defiziente [Su(H)S269A] und phospho-mimetische [Su(H)S269D] Varianten erzeugt. Su(H)S269D betrifft die DNA-Bindung und zeigt reduzierte transkriptionelle Aktivität bei Überexpression in vivo. Dagegen wirkt Su(H)S269A etwas aktiver. Offenbar hemmt pS269 die Su(H) Aktivität. Per genome Engineering wurden diese Mutationen in den nativen Su(H) Locus gebracht. Su(H)S269D ähnelt wegen des DNA-Bindedefekts einer Nullmutante, während homozygote Su(H)S269A Tiere phänotypisch unauffällig sind. Jedoch ist die Hämatopoese gestört, da Kristallzellen (einer der drei Blutzelltypen) in Larven gehäuft auftreten. N reguliert die embryonale und imaginale Hämatopoese. Phosphorylierung von Su(H) könnte in diesem Kontext die N-Aktivität hemmen und das Verhältnis der Blutzelltypen beeinflussen. Auch im Säuger unterliegt die Hämatopoese der N-Regulation. Die Konservierung der pS269-Stelle spricht für eine analoge Regulation im Säuger. Dieser Mechanismus soll nun aufgeschlüsselt werden. Mittels Zellmarkern wird geprüft, ob überzählige Kristallzellen embryonal angelegt sind oder per Transdifferenzierung (auf ein externes Signal hin?) larval entstehen. Im Mittelpunkt steht die Identifikation und Analyse der verantwortlichen Kinase/n. Der Einfluß potentieller Kinasen auf die Kristallzellzahl wird in entsprechenden Mutanten bzw. RNAi-Linien bestimmt. Solche mit erhöhter Kristallzellzahl werden mit den Su(H) Mutanten re/kombiniert: da Su(H) nachgeschaltet sein sollte, sollte die Kristallzellzahl in den Doppelmutanten gleich der der Su(H) Mutanten sein. Können die selektierten Kinasen Su(H) in vitro phosphorylieren? Ändern sie die N Signalaktivität in vivo, z.B. als pseudo-aktivierte bzw. dominant-negative Version? Zum direkten Nachweis von pS269-Su(H) soll die Phos-Tag Methode etabliert sowie Phospho-spezifische Antikörper generiert werden. Erstere ermöglicht eine grobe Auflösung der pS269-Su(H) Verteilung, letztere im Optimalfall die in situ Detektion. Zur Analyse der Konservierung dieses Regulationsmechanismus’ im Säuger haben wir bereits Fliegen erstellt, die murines RBPJ anstelle von Su(H) tragen, um nun die Blutzelltypen in phospho-Mutanten (RBPJS221A, RBPJS221D) zu untersuchen. In Kollaboration mit F. Oswald (Uni Ulm) werden mit diesen Mutanten Funktionsanalysen in T-Zellen durchgeführt. Zudem werden homologe Kinasen mittels Überexpression bzw. Inhibitoren getestet. Auch sollen Leukämie-Datenbanken auf Mutationen in verwandten Kinasen durchforstet werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen