Visualisierung der Hepatitis C Virus Morphogenese

• Antragsteller: Professor Dr. Michael Schindler
• Fachliche Zuordnung: Virologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 399732171

Zur optimalen Replikation haben Viren Strategien entwickelt, um zelluläre Vorgänge zu manipulieren und für ihre Zwecke zu entfremden. Deshalb kann die Analyse viraler Vermehrung und Replikation zu grundlegend neuen zellbiologische Erkenntnissen führen.Ziel dieses Antrags ist es, die wenig verstandenen Mechanismen der Hepatitis C Virus (HCV) Morphogenese und die zellulären Transportwege, die an der Freisetzung infektiöser Partikel beteiligt sind, aufzuklären. Unsere publizierten Vorarbeiten, die auf komplementären biochemischen und Bild-gebenden Verfahren beruhen, deuten darauf hin, dass HCV unter anderem das endosomale Kompartiment zur Freisetzung nutzt und über einen ungewöhnlichen Golgi-unabhängigen sekretorischen Transportweg ausgeschleust wird. Ausgehend hiervon formulieren wir die zentrale Hypothese, dass HCV unter Umgehung des Golgi-Apparats einen bisher unbekannten nicht näher definierten sekretorischen Transportweg nutzt. Wir planen zelluläre Faktoren dieses Transportwegs zu identifizieren, indem wir HCV Reportergenome in Kombination mit hoch-auflösender Mikroskopie und genetischen Verfahren nutzen. Wir haben Reporterviren etabliert, die das Fluoreszenzprotein mCherry oder eine Nano-Luziferase im viralen Hüllprotein E1 exprimieren. Die Freisetzung dieser Viren ist vergleichbar zu nicht-markierten WT Viren und somit geeignet, um intrazellulären Transport und Freisetzung in lebenden Leberzellen zu analysieren. Wir werden E1-mCherry markiertes HCV einsetzen, um Virusassemblierung und Freisetzung mit hochauflösenden mikroskopischen Verfahren zu untersuchen, unter anderem strukturierte Illumination (3D-SIM) und und "fluorescence recovery after photobleaching" (FRAP). Um zelluläre Faktoren und spezifische Kompartimente die mit intrazellulärem HCV Transport assoziiert sind zu identifizieren, werden wir HCV E1-mCherry mit Vektoren, die zelluläre Markerproteine als Fusionsprotein mit GFP exprimieren, kotransfizieren. Funktionell werden diese Experimente durch siRNAs gegen zelluläre Faktoren, Inhibitoren diverser Transportwege und die Analyse von Virusmutanten, die an spezifischen Schritten der HCV Freisetzung Defekte aufweisen, flankiert. Des Weiteren werden wir Experimente in primären humanen Hepatozyten durchführen, um zentrale Ergebnis in relevanten Systemen zu verifizieren.Wir schlagen ein innovatives und komplementäres Arbeitsprogramm vor, um zelluläre Faktoren und zellintrinsische Transportwege zu identifizieren, die an der Freisetzung von HCV beteiligt sind.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen