Bestimmung der Verwundbarkeit essentieller Gene von Pseudomonas aeruginosa mithilfe von CRISPR interference (CRISPRi)

• Antragstellerin: Dr. Anne-Sophie Herbrüggen
• Fachliche Zuordnung: Parasitologie und Biologie der Erreger tropischer Infektionskrankheiten ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 395641632

Pseudomonas aeruginosa ist ein Gram-negativer Krankenhauskeim, der vor kurzem von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) zu der Liste der pathogenen Bakterien hinzugefügt wurde. Für diese Bakterien müssen dringend neue Antibiotika gefunden werden, um multiresistente Keime bekämpfen zu können. Ein Weg neue Targets für die Antibiotikaentwicklung zu finden, besteht darin, essentielle Gene zu identifizieren. Allerdings ist ein essentielles Genprodukt nicht per se ein gutes Target für neue Antibiotika. Ein Präparat, das im Zytosol des Bakteriums wirken soll, muss zunächst sowohl die äußere als auch die innere Zellmembran überqueren um zu wirken. Durch den aktiven Export mithilfe von mindestens 12 ‘resistance-nodulation-cell division’ (RND) Effluxpumpen besitzt P. aeruginosa eine besonders starke Barriere für Antibiotika, die eine Anreicherung des Antibiotikums im bakteriellen Zytosol verhindern. Deswegen könnten Inhibitoren, die auf exportierte Proteine wirken (z.B. Proteine, die sich im Periplasma, der inneren- oder äußeren Membran befinden), eine höhere Wirksamkeit gegen Gram-negative Bakterien erzielen, solange sie die äußere Membran durch ‘outer membrane proteins’ (OMPs) passieren können. Ein Beispiel hierfür sind beta-lactam Antibiotika. Andere Antibiotika, wie z.B. Colistin, wirken auf die Integrität der äußeren Zellwand und können auf so ihre antibaktirielle Wirkung entfalten. Abgesehen von der Erreichbarkeit des Targets spielt auch die Menge eines Inhibitors, die notwendig ist um baktierelles Wachstum zu blockieren, eine wichtige Rolle für die Entwicklung neuer Antibiotika. Somit sind hoch verwundbare Targets zu favorisieren, da eine geringere Konzentration des Wirkstoffes ausreicht, um bakterielles Wachstum zu verhindern. In dieser Studie wollen wir das ‘CRISPR interference’ (CRISPRi) System in P. aeruginosa etablieren. Anhand dieser Methode kann die Expression essentieller Gene einfach manipuliert werden und eignet sich somit für ein Hochdurchsatzverfahren. Mit diesem Verfahren wollen wir die Verwundbarkeit von allen exportierten Genprodukten untersuchen, die außerdem in Transposon-Mutagenese Studien als essentiell identifiziert wurden. Dazu werden wir mit CRISPRi die Expression von exportierten, essentiellen Genen herabsenken. Anhand der Zellviabilität oder der Wachstumshemmung können wir dann die Verwundbarkeit dieser Gene bestimmen. Abgesehen davon werden wir die morphologischen Effekte, die bei der Runterregulierung der Expression von essentiellen Genen entsteht, mithilfe von ‘live-cell imaging’ in einer mikrofluidischen Kammer charakterisieren. Die Erkenntnis, welche essentiellen, exportierten Genprodukte auch hochverwundbar sind, wird dabei helfen, Targets ihrer Erfolgswahrscheinlichkeit nach für die Entwicklung neuer Antibiotika gegen P. aeruginosa Infektionen zu sortieren.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Professor John J. Mekalanos, Ph.D.