Struktur, Dynamik und Faltungskinetik von G-Quadruplex-Nukleinsäuren

• Antragsteller: Professor Dr. Harald Schwalbe
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Analytische Chemie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 392117191

In diesem Antrag wollen wir die Energetik der Faltung von G-Quadruplex-Strukturen untersuchen. Dabei wollenw ir eine Kombination verschiedener biophysikalischer Methoden anwenden, insbesondere die zeitaufgelöste NMR-Spektroskopie. Unsere experimentellen Ergebnissen sollen die Grundlage für Moleküldynamiksimulationen bilden, die J. Sponer (Brno University) druchführen wird. Moderne chemische und biochemischen Methoden für die Synthese isotopenmarkierter DNA und "caged"-DNA werden entwickelt und angewendet werden.Die Strukturen von G-Quadruplexen sind sehr polymorph, ihre Faltung kann sich hinsichtlich Strangorientierung, Geometrie von Schleifenbereichen sowie bzgl. der glykosidischen Torsionswinkel unterscheiden. Es gibt immer mehr Hinweise, dass G-Quadruplexe regulatorische Funktionen in einer Vielzahl biologischer Prozesse ausüben. So werden G-Quadruplexe im 3'-Überhang von Telomeren und in den Promotorregionen von vielen Onkogenen gefunden, weshalb sie als neues Target einer Antikrebstherapie angesehen werden. Demgegenüber ist unser Verständnis von Struktur und Faltungsdynamik von G-Quadruplexen noch rudimentär. Auf der Basis der bisherigen insbesondere theoretischen Abreiten geht man von einer sehr rauhen Faltungslandschaft ("rugged energy landscape") mit einer Vielzahl lokaler Minima und langsamer Faltungskinetik aus, die einer kinetische Partitionierung unterworfen ist.Echtzeit-NMR-Spektroskopie ist in herausragender Weise in der Lage, Informationen über die Kinetik der Faltung mit atomarer Auslösung zu bestimmen.Deshalb wollen wir Echtzeit-NMR nutzen, um die Faltungskinetiken von DNA- und RNA-G-Quadruplexen zu nutzen. Hierbei werden zwei unterscheidliche Ansätze verfolgt:Der erste Ansatz ermöglicht die Auslösung der Faltung durch KCl-Injektion direkt im NMR-Probenröhrchen mittels eines schnellen Injektionssystems. Der zweite Ansatz beruht auf dem Photoschutz einzelner Guaninreste, die in der Gruppe Heckel synthetisiert werden, um Oligonukleotide in einer von verschiedenen Konformationen einzufrieren oder den entfalteten Zustand zu populieren. Die Rückfaltung wird dann durch Laserbestrahlung der mit Photoschutzgruppe ausgestatteten DNA/RNA direkt im NMR-Röhrchen mittels Laserlicht, das über Quartzfaser eingekoppelt wird, initiiert. Insbesondere wollen wir mit diesem Photo-Cage-Ansatz den Prozess des G-Register-Austausches in G-Quadruplexen untersuchen, die mehr als 3 Guaninnukleotide pro G-Trakt besitzen. Unsere NMR-Daten werden komplementiert durch Messung der Aktivierungsenergien aus UV-vis-Hysterese-Experimenten (Mittermaier-Gruppe). Diese Information bildet die Grundlage für zukünftige MD-Simuationen (Sponer group), die Aufschluß über schnell gebildete Faltungsintermediate liefern kann, die nicht mittels NMR nachgewiesen werden können.Weiterhin wollen eine enzymatische Methode auf der Grundlage der "rolling circle amplification (RCA) für die Herstellung von 13C,15N markierter einzelsträngiger DNA in mg-Mengen etablieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen