Analyse der molekularen Mechanismen der Bs3-vermittelten Zelltodreaktion in Pflanzen

• Antragsteller: Professor Dr. Thomas Lahaye
• Fachliche Zuordnung: Organismische Interaktionen, chemische Ökologie und Mikrobiome pflanzlicher Systeme
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 388775801

Das Paprika Resistenzgen (R) Bs3 wird durch das Xanthomonas TALE-Protein AvrBs3 transkriptionell aktiviert. Bs3 ist ein strukturell einzigartiges R-Protein, das auf bislang noch unbekannte Weise Zelltod auslöst. Bs3 weist Homologien zu YUCCAs auf, einer Pflanzen-spezifischen Familie Flavin-abhängiger Monooxygenasen (FMOs), die Zellvermehrung aber nicht Zelltod induzieren. YUCCAs binden NADPH2 und O2 und konvertieren Indol-3-essigsäure (IPA) in Auxin (IAA). Alternativ übertragen YUCCAs Reduktionsäquivalente direkt auf O2, wobei H2O2 entsteht. In der Pflanze bedingt die Bs3-Expression erhöhte H2O2- nicht aber erhöhte IAA-Level, was daraufhin deutet, dass Bs3 durch H2O2-Synthese Zelltod auslöst. In der Tat produziert rekombinantes Bs3 5-fach höhere H2O2-Mengen als YUCCA6 aus Arabidopsis. Photometrische Analysen zeigen, dass O2-beladenes Bs3 weniger stabil ist als O2-beladenes YUCCA6, was erklärt, warum Bs3 mehr H2O2 produziert als YUCCA6. Domänen-Austausch-Experimente zeigten, dass polymorphe Bereiche in Nachbarschaft eines konservierten Cysteins funktionale Unterschiede zwischen Bs3 und YUCCA6 bedingen. Der Arabidopsis Transkriptionsfaktor TCP9 wurde in einem Hefe-Dihybrid-Screen als Bs3 Interaktor identifiziert. Bekannt ist, dass die Bindung von TCP-Proteinen an DNA Redox-reguliert ist und dass TCP9 die Expression der Isochorismat-Synthase aktiviert, ein Schlüsselenzym der Salizylsäure (SA)-Synthese. In der Tat korreliert der von Bs3 induzierte Zelltod mit einem SA-Anstieg, was unser Arbeitsmodell stützt, in dem Bs3 mittels H2O2-Synthese TCP9 aktiviert.Im Rahmen des Antrags sollen zwei Aspekte des Bs3-vermittelten Zelltods analysiert werden: Erstens wollen wir die funktionalen Unterschiede zwischen Bs3- und YUCCA-Proteinen klären unter Identifizierung der kausalen Polymorphismen. Zweitens sollen Bs3-Signalkomponenten identifiziert und analysiert werden. Für eine in vivo Analyse der Bs3- und YUCCA6-abhängigen H2O2-Synthese werden Fusionen an visuelle und funktionelle Reporter erstellt. Komplementär werden mittels hochauflösender Mikroskopie räumliche Korrelationen zwischen Bs3/YUCCA6 und H2O2 untersucht. Durch Kombination Thiol-spezifischer Sonden mit Massenspektrometrie (MS) sollen Redox-sensitive Cysteine in Bs3/YUCCA6 identifiziert werden. Die Art der Thiol-Modifikation und deren funktionale Relevanz sollen bestimmt werden. Um Bs3/YUCCA6-spezifische Interaktoren zu isolieren, werden wir Co-Immunopräzipitationen (CoIP) gekoppelt mit MS-Analysen durchführen. Da H2O2, produziert von Bs3, wahrscheinlich eine Sulfenylierung Redox-regulierter Signalkomponenten bedingt, werden wir Sulfensäure-spezifische Sonden in CoIP-MS Ansätzen nutzen, um Redox-regulierte Proteine zu identifizieren. Die funktionale Relevanz putativer Bs3-Signalkomponenten wird durch die Analyse entsprechender Arabidopsis- und/oder Paprika-Mutanten hinterfragt werden. Unsere Studien werden erste mechanistische Einsichten in die Bs3-abhängige Zelltodreaktion liefern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen